实时荧光定量聚合酶链反应筛选重组人骨形态发生蛋白-2诱导比格犬骨髓基质干细胞成骨分化差异表达的miRNAs

　　自体骨髓基质干细胞(boneO5marrowO5mesenchymalstemO5cell,O5BMSCs)移植是近年来提出的治疗难治性骨疾病的一种新的治疗方式。BMSCs是存在于骨髓基质的非造血细胞来源的细胞亚群，取材方便，培养简单，可以在体外扩增，向多谱系转化而不丧失遗传稳定性，已成为最有前途的骨组织工程种子细胞。骨形态发生蛋白(boneO5morphogeneticO5protein,B11P)是研究较早的骨生长因子，其诱导成骨的作用已多次被实验听证实。它是目前惟一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，在一定条件下，能诱导米分化的间充质细胞向骨系细胞转化，促进骨细胞的生长增殖目前认为BMP是骨组织土程中促进成·胃作用最重要的一种枯〕但BMP诱导成骨分化的分子机制仍不清楚微小RNA(microO5RNA,O5miRNA)是一类具有组织特异性或发育阶段特异性表达特征的非编码调控小RNA，长度范围为16O5}O529O5nt，平均为22O5nt。研究发现miRNA存在于几乎所有真核生物和一些病毒中，调控了超过30%的蛋白质编码基因，广泛影响细胞增殖、分化、凋亡及个体生长发育。近年来，miRNA与骨形成和代谢的关系也受到很多研究者的关注。　　本研究拟分离培养比格犬BMSCs，并用重组人骨形态发生蛋白一2(recombinantO5humanO5boneO5morpho-geneticO5protein-2O5rhBMP)刺激诱导其成骨分化，然后采用实时荧光定量聚合酶链反应(realO5timeO5quanti-tativeO5polymeraseO5chainO5reaction,O5O5Q-PCR)技术分析rhBMP-2诱导成骨分化过程中差异表达的miRNAsO5,并初步验证其对成骨分化的影响，为进一步理解rhBMP-2作为成骨分化诱导因子诱导BMSC*成骨分化的分子机制提供新的研究基础材料与方法一、实验材料成年比格犬4只(由南方医科大学实验动物中心提供)，体质量15一19O5kg;O5rhBMP-2(杭州九源基因工程有限公司)，质量百分比纯度超过98%;淋巴细胞分离液(Sigma公司，美国)，TRlzol试剂盒、转染试剂ransfectamin2000O5(O5Invitrogen公司，美国),O5Q-PCR引物(由广一州市启动子生物科技有限公司设计，由上海英骏公司合成)，逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]，Q-PCO5R试齐l]盒QuantitectO5SYBRO5GreenO5PCRO5Kit及Q-PCR仪MY3005PO5multiplexO5quantitativeO5PCRO5sys-temO5(O5Stratagene公司，美国)，miRNAO5mimics及其对照mimics-1O5CO5(由上海吉玛制药技术有限公司合成)，倒置相差显微镜(OLYMPUS公司，日本)。　　二、实验方法　　1.O5BMSC*的分离培养:按标准骨髓穿刺程序，从比格犬骼后上棘抽取骨髓5一10O5mL,肝素抗凝，用等量的磷酸盐缓冲液(phosphateO5bufferedO5saline,O5PBS)稀释，按2:O51比例加人淋巴细胞分离液中，400O5g离心30O5min(离心半径13.O55O5cm)，取中间白膜层，用PBS洗涤2次，计数，以1O5xO510}个细胞接种于含基础培养基的培养皿中培养。基础培养基配方:含体积百分比为10%胎牛血清(fetalO5calfO5serumO5,O5FBS)的低糖培养基(Dulbecco'sO5ModifiedO5Eagle'sO5Medium，DMEM)，100U/mL青霉素，100O5U/mL链霉素。培养条件:37℃、体积百分比为5%的C0}O5,湿度为95%培养72O5h后首次换液，以后每3d换液I次。传代培养时，PBS洗涤2次，加人体积百分比0.O525%胰酶一乙二胺四乙酸(trypsinO5O5O5ethyleneO5O5O5diamineO5O5O5O5O5O5tetraaceticO5O5O5acid，trypsin-ED'I'A)消化2O5min,等量10%O5O5FBS的低糖DMEM培养基终止消化，150O5g离心5O5min，弃上清，按lxlJ/皿接种于培养皿中。　　2.实验分组及BMSCs的成骨分化培养:取培养至第3代细胞，0.O525%O5trypsin-EDTA消化后，以3x10/皿接种于10O5em培养皿中，分为2组:对照组(用基础培养基培养)和实验组(在基础培养基中加人rhBMP-2培养7d，诱导细胞成骨分化)，用于miRNA:筛选。各组每3d更换一次培养基，同时两组各准备2个孔板}6孔)，用于碱性磷酸酶(alkalineO5phosphates,O5O5ALP)染色，鉴定BMSCs的成骨分化效果。　　参考文献　　刘伟,刘萌,祝劲松. 人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化[J].中国组织工程研究,2012,(14):2515-2519.doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.009.　　Potier E,Noailly J,Ito K. Directing bone marrow-derived stromal cell function with mechanics[J].Journal of Biomechanics,2010,(5):807-817.doi:10.1016/j.jbiomech.2009.11.019.　　Bramono DS,Murali S,Rai B. Bone marrow-derived heparan sulfate potentiates the osteogenic activity of bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2)[J].Bone,2012.954-964.　　Rui YF,Lui PP,Lee YW. Higher BMP receptor expression and BMP-2-induced osteogenic differentiation in tendon-derived stem cells compared with bone-marrow-derived mesenchymal stem cells[J].International Orthopaedics,2012.1099-1107.　　Song L,Tuan RS. MicroRNAs and cell differentiation in mammalian development[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2006.140-149.　　Schmittgen TD,Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method[J].Nature Protocols,2008.1101-1108.　　Livak KJ,Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T[J].Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2001.402-408.　　Pontikoglou C,Deschaseaux F,Sensebé L. Bone marrow mesenchymal stem cells:biological properties and their role in hematopoiesis and hematopoietic stem cell transplantation[J].Stem Cell Rev,2011.569-589.　　胡稷杰,金丹,全大萍. 负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验[J].第一军医大学学报,2005,(11):1369-1374.doi:10.3321/j.issn:1673-4254.2005.11.009.　　胡稷杰,金丹,全大萍. 负载不同浓度骨形态发生蛋白的组织工程骨体内成骨的量效关系[J].中华骨科杂志,2006,(3):196-201.doi:10.3760/j.issn:0253-2352.2006.03.012.