蛋白质组学在股骨头坏死中的研究进展

人体内真正发挥作用的是蛋白质，基因的重要作用最终通过蛋白质体现，囚此，随着人类菜因序列竿图的完成生命科学研究进人了一个崭新的后基因组学时代，即蛋白质组学时代与基因组学研究不同，其可获得蛋白质的亚型、转录后蛋白调节的信息，弥补基因组学缺陷，直接揭示基因的功能1。利用蛋白质组学技术可以从蛋白质分子水平深刻认识疾病的病理机制，筛选鉴定出疾病特异N}生物标记物明确疾病的发病机制，并探索新的治疗方法2股哥头坏死(osteone-crosisoffemoralhead,ONFH)，又称缺而性股骨头坏死，是由于不同原因破坏了股骨头血液供应所造成的最终结果，是骨科领域常见的难治性疾病口前国内外对ONFH的发病机制的研究仍处于探索阶段，旱一期诊断和治疗也有待于进一步探究.以往细胞学、基因组学平台上的研究已不能满足探索ONFH未知领域的要求，需要新兴的分子生物学技术来开拓一个崭新的科技研究平台，蛋白质组学技术的发展为股骨头坏死等发病机制尚不明确的疾病的诊断和治疗研究提供了新的途径因此蛋白质组学技术在股哥头坏死研究中越来越受到重视,本文就目前研究股骨头坏死常用的蛋白质组,研究技术及近年来有关股骨头坏死蛋白质组学的研究成果展开综述。1蛋白质组学相关研究技术蛋白质组学(proteomics)是以细胞、组织、生物体内蛋白质组成及其活动方式(表达、翻译及修饰、功能等)为研究对象，研究其结构、功能、相互作用和修饰的一门新兴且迅速发展的学科目前在骨科中以双向电泳、质谱分析及液质联用等蛋白质组学技术最为常用，主耍用十蛋白分离和鉴定。1.1双向电泳(2-DE)蛋白质双向电泳技术是各种蛋白质分离分析方法中惟一能同时分辨上千个蛋白质点的技术气尤其适用于不同状态下细胞蛋自质表达差异的研究。其原理是蛋白质等电点不同，在PH梯度胶内进行一维等电聚焦分离蛋白，然后经聚丙烯酞胺电泳法，按分子质量进行二维电泳分离，分离后进行染色和蛋白点分析通过软件定量分析实验组和对照纵中蛋白点的不同密度利用蛋白酶将感兴趣的蛋自点从凝胶上切下，以质谱和序列数据搜寻鉴定蛋自。双向电泳的高分辨率，重复性好和兼具微景制备的性能是其他蛋白质分离方法所不能匹敌的，但仍存在一些缺点，如低丰度蛋白质，疏水蛋白的分离检测，巨有限的运动范围和不能对超过一定分子量范围的蛋白质进行分析.1.2生物质谱技术(MS)MS技术的发展能进一步对2-DE所分离的成千上百种蛋白质进行分析。MS是通过离子化装置将分子转化为气态离子，根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定相对分子量，进行网上数据对比从而鉴定蛋白质.氨基酸序列及翻译后修饰情况等。其方法主要有两种，即肤指纹图谱技术和串联质谱技术。肪指纹谱技术是将特定序列的蛋白酶水解成多肪斑点后得到的几个肤段的质量.然后用这些肤段质量查询数据库如enbank,PIR蛋白数据库、EMBL}1叹得到研究蛋白质的结构和功能。对于不能单独依靠肤指纹图谱鉴定的蛋白质可用肪序列标签串联质谱鉴定技术测定蛋自质的氨基酸序列。利用这些技术再进行蛋白质数据库检索，可实现对蛋自质快速鉴定和高通量筛选.1.3液质联用(HLPC-VIS)液质联用(HLPC-NT淤又叫液相色谱一质谱联用技术，体现了色谱和质谱优势的互补，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。将色谱对复杂样品的高分离能力，与NIS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，这些高通量技术在骨组织蛋白中的应用为疾病诊断，生物标记物的发现等垮出了重要一步.2蛋白质组学在股骨头坏死中的应用目前对ONFH的蛋白质组学尚处于初级阶段.国内外其研究对象主要包括:股骨头坏死患者的股骨头骨组织、血清及相关动物模型的股骨头。2.1 ONFH患者的坏死股骨头与正常股骨头间的差异蛋白应用蛋白质组学技术分析ONFH患者坏死股骨头和正常股骨头之间的差异蛋白质，寻求可以用于股骨头坏死早期诊断及防治的蛋白质标记物。Tan等X13一应用蛋自质组学技术分析了坏死股骨头与正常股骨头之间蛋白质的变化，共发现7个相关蛋白质，且其中4个相关蛋自在股骨头坏死患者中的表达明显高于类风湿性关节炎，骨关节炎和骨折患者这些特征性指标的发现有利于ONFH早期诊断鉴别和发病机制的研究。Zhang等na通过蛋白质组学技术发现股骨头坏死患者中有141个蛋白表现上调，56个表现下调，且表明硫酸软骨素蛋白多糖，阳离子运输和动员合成可能是股骨头坏死发病过程中的一个关键环。张雷等寻找与成人非创伤h,}股骨头坏死缺血性相关的蛋白质鉴定出差异表达蛋白189个其中坏死组表达量上调3倍以上的蛋白点104个，下调3倍以上的50个。通过基因本体论蛋白功能分析发现，其中34种蛋白质与股骨头缺血性坏死密切相关。)GPCR26和CHST2表达下调，且蛋白印迹实验验证了质谱鉴定结果。这此蛋白质可能成为股骨头缺血性坏死早期临床诊断的候选生物学标志物，随着对这两个蛋白的作用机制研究深人，可为阐明股骨头缺血性坏死的发病机制提供了一条新途径。骨组织是一种比较特殊的生物标本，又是研究股骨头坏死必不可少的实验材料。其样本质地坚硬、矿物质含量高，细胞含量较少，如何将其有一效破碎、及促使骨组织细胞成分中蛋白充分溶解，并把复杂的蛋白质成分有效分离，对于后续进行差异蛋白质分析和鉴定至关重要。崔永锋等通过2种不同提取液提取蛋白.发现三氯乙酸丙酮沉淀法能有效提高r骨组织蛋白的提取率。Vincourt等“利用基质的生物学特征改进传统的软骨组织蛋白提取等由此可见通过改进可以获得快速，有效的骨组织蛋白提取方法，这将有利于骨组织蛋白质组学研究。2.2ONFH患者与正常人血清之间的差异蛋白分析股骨头坏死患者和正常人股骨头的血清蛋白质组的差异，寻求司-能获得与疾病相关的蛋白质，这些血清蛋白质学标志物可以用于诊断和发病机制的研究血清标本易于采集，信息含量丰富，是蛋白质组学主要的研究对象。Wu等比较了成人股骨头坏死和健康志愿者之间血清中的蛋白质差异，发现股骨头坏死患者中的变异激肤原一叭补体因子C3的前体以及补体因子H均有明显的升高，而抗凝血酶111链乙、载脂蛋白A一W前体和凝胶溶素a异构体水平出现明显的降低，表明股骨头坏死的发生与以上各种血清蛋白的表达有关。Jiang等’s{采用2-DE和MALDI=1'OFMS技术比较正常健康女性人员(A),SARS康复无并发症女性人员(B),SARS康复伴发伴股骨头坏死女性人员(C)3组血清中的蛋白质差异，初步鉴定了18个差异蛋白，与A组和B组比较，C组4种蛋白降低，3种蛋自高表达。其巾C组血清淀粉样P物质与A组和B组比较，其高表达(P<0.05)，因此认为血清淀粉样P物质可能是SARS患者股骨头坏死的一个生物标v己物，叫一作为ONFH的诊断和治疗血清淀粉样P物质功能及具体的作用机制有待十进一步研究血清标本易于获取，但血液蛋白质组成分复杂，高低丰度蛋白质含量的动态范围非常宽如何有效地尽量去除高丰度蛋白质，实现富集低丰度蛋白质，发现其在低丰度蛋白质中的侯选标志物己有学者对此进行了优化.2.3相关动物模型建立的蛋白质组学实验研究建分_动物模型提取骨织织蛋白样品分析，鉴定出差异蛋白.且可通过药物早期干预治疗对照寻求股骨头坏死的发病及药物治疗可能发挥的作用动物模型是研究股骨头坏死重要的工具。股骨头坏死的发生机制极其复杂.所以研究者们根据研究目的建立了许多动物模型模拟人类的股骨头坏死刘建仁等}zo;用激素制造大鼠骨坏死模型并设中药治疗组和空白对照组.运用蛋白质组学技术，提取骨组织蛋口质样品进行分析，初步签定了3个差异蛋白，阻凝蛋白重连IIB,磷脂谷眺廿肤过氧分酶泛素化酶E2(Mw:l7kd)，并分析3种蛋白在激素性股骨头坏死中发病及中药治疗激素性股骨头坏死过程中可能发挥的作用为股骨头坏死的发病和药物治疗分子水平上做了进一步的研究Li等.,采用2-DE和'}-TALDI=FOFMS技术，验证了甲强龙诱导的鸡股臀头坏死中骨髓脂肪细胞的变化共发现9种蛋白表达下调，因此认为蛋白质组学能很好的探测骨髓脂肪细胞在激素性鸡股骨头坏死的变化。胡蜂等23用激素建立新西兰大白兔股骨头坏死模型，采用2-DE技术创建旱期ONFH不同时点与正常股骨头的蛋白表达图谱，运用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MAT,DI-TOF-MS)对差异点进行鉴定通过比较后发现24个差异蛋白点(差异大于2倍)，经质谱成功鉴定出20个，其中7种蛋白质在早期ONFH中呈现表达上升，另外13种蛋白呈现表达下降。Westernblot显示早期ONFH中AnnexinAl的表达水平低于对照组，其表达趋势与2-DE结果相一致。AnriexinAl是钙离子依赖结构相关磷脂结合蛋白，众多研究表明，它与细胞信号传导、炎症介导、细胞凋亡、细胞修复、肿瘤进程等密切相关此外还发现其在成骨细胞分化，软骨矿化过程及骨细胞扩增的调节发挥这重要的调控作用z5},AriIleX1111很可能通过上述或其他途径参与了早期ONFH的发病过程.是潜在的重要蛋白标志物，值得进一步深人研究.3展望综上所述，蛋白质组学研究平台的建立为股骨头坏死的研究提供了一个新的契机，随着研究技术不断进步也取得一些研究成果。但目前对股骨头坏死的蛋白质组学研究还处于起始阶段，蛋白质组学技术还需进一步发展，骨组织及血清样本中蛋白提取方法一也需优化和统一，目前发现的差异蛋白质也较少，其具体的功能及与疾病的发病机制，治疗等都还需要进一步探索.日现有相关的蛋白组数据库也仍然比较有限目前股骨头坏死仍以寻找其发摘机制、旱期诊断和早期治疗的相关蛋白及其功能鉴定，建立早期的相关数据库为研究热点和焦点但随着蛋白质组学的迅速发展，运用蛋自质组学技术深入研究Oi\FH的分子发生发展机制，找差异表达蛋白.有望在ONF'H的早期诊断和治疗中带来重大突破参考文献Yeatman TJ. 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