富血小板血浆对骨折愈合影响的研究进展

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是通过离心获得的，高于生理浓度数倍的血小板血浆，主要是通过释放血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor，IGF)等细胞因子[1]，发挥修复作用。现在认为PRP中的血小板浓度至少要高于生理全血中浓度4倍，才能达到有效的治疗效果，同时Weibrich等通过不同浓度的富血小板血浆修复骨缺损，发现其浓度与生物学效应并不完全成正比，最佳治疗浓度在4~7倍之间[2]。自Marx[3]等于1998年首次用PRP复合植骨来修复下颌骨的骨缺损以来,国内外已经将其应用于口腔、骨科、整形等多个领域。PRP在动物和临床实验中表现了良好的促进骨修复的特性。1富血小板血浆的制备方法目前，尚无统一标准化的PRP的提取方法，按制备程序，可以分为一次离心法、二次离心法和三次离心法，大量的研究和室验表明，使用二次离心法PRP的提取率最高，临床应用最广。PRP的制备原理，是根据血液中各个组分的沉降系数不同，通过离心将他们分离，具体制备步骤如下：(1)抽取静脉血液并且将其注入含有抗凝剂的试管内，准备离心。(2)在离心机上进行离心，第一次离心后，血液分为3层，最底层是沉降系数最大的红细胞层，约占血液总体积分数54%，最上面是上清液约占41%，交界处有一薄层，就是富血小板血浆层。(3)用移液器吸取上清液和PRP层，将其注入另外一个不含抗凝剂的试管中。(4)再次进行离心，将血浆分为3层，最底层是少量剩余的红细胞，顶层是含量最多的上清液，两层之间就是富集的血小板。再用移液器吸去大部分上清液，并留足够的血浆来容纳其中的血小板，最后得到的就是PRP。国内大多仍使用传统的实验室制备方法，但由于有以下缺点限制了临床推广应用[4]，主要是容易污染，容易激活PRP，回收率相对较低，变异系数大等。PRP的制备方法多种，不同的离心次数，力量和时间制备出来的PRP中血小板的体积分数及生长因子的量活性各不相同，主要有Anitua法、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法，目前对于传统的制备方法还存在争议，国内学者认为Landesberg法较为理想，它制作的血小板体积分数最高，活化率最小，对牵张成骨中新骨的生成有显著的促进作用。Landesberg法操作时要求无菌操作，第一次用200g的力离心10min，吸取全部上清液至交界面下3mm，将其移至另外一个离心管中，平衡后再以200g的力离心10min，离心管中液体分为两层，吸取约3/4上清液弃掉，剩余的为PRP。而Mark[5]认为，制作PRP时先需要高速离心，弃去上清液后在低速离心，可以更好的提取血小板。目前商业化生产的PRP制备系统已经能够快速稳定地获得高质量的PRP，但是这些系统价格昂贵，不能广泛推广。2富血小板血浆的分类由于制备的技术和设备不同，临床应用的PRP并不是相同的，根据其含有的白细胞多少大致分为两种：富白细胞的PRP和贫白细胞的PRP[6]。白细胞和血小板有相近的沉降系数，含量都很少，在相同离心力作用下，很难将二者分开。大多数文献中提到的PRP大都是富白细胞的PRP,白细胞释放的递质会诱导多种细胞的积聚和黏附，更有利于组织愈合。根据应用形式可以分为激活后的PRP，未激活的PRP，前者又包括PRP凝胶和PRP释放物。PRP释放物通常是指血小板活化后释放入血浆或者血清中含有的生长因子和活性蛋白的上清液;PRP凝胶是血小板激活后释放生长因子的同时，释放出的纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，形成的肉眼可见的凝胶物。激活PRP的方法多种，有添加凝血酶和钙剂，冻结，融化等，对于那种激活方式更充分，目前尚无研究证明。另外应用于体内时，是否需要体外激活目前是有争议的，因为体内有足够的内源性凝血酶原激酶。无论何种方法制作的PRP，在其应用之前需与激活剂按l:1比例混和，激活剂为10%氯化钙溶液和100 U/mL牛凝血酶混和制成，与少许空气混和、摇匀，经6～10S(秒)后即制成PRP凝胶，再与移植物材料混和后充填于骨缺损区。3富血小板血浆对骨折愈合的影响PRP促进骨折愈合是通过血小板释放其内容物起作用的，血小板内含有生长因子、纤维蛋白、组织蛋白酶-A等，其中PDGF、TGF-β最为重要。生长因子通过跨膜受体结合到靶细胞的细胞膜外面，激活细胞内第二信号，诱导细胞内基因表达，使细胞增殖，胶原合成[7]。TGF-β是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白。TGF-β刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化、有丝分裂，诱导PDGF、TGF-α等因子的产生，促进细胞外基质如胶原与纤维蛋白的合成，抑制金属蛋白酶的活性，有助于细胞外基质沉积和纤维化的形成，同时抑制破骨细胞的形成和骨吸收[8]。PDGF主要作用是促进有丝分裂，促进间充质细胞的生长分化，对碱性磷酸酶的合成和成骨细胞胶原蛋白的合成没有明显影响，但能加速血管生成，增加巨噬细胞的活性促进创伤部位的修复。PDGF受体广泛分布于间充质细胞，能促进供区骨髓间充质干细胞增殖分化，同时促进成骨细胞有丝分裂和血管新生，并能趋化激活巨噬细胞，其作用强度与其它细胞因子间存在协同效应，并表现出与剂量呈正相关。对于PRP对骨折的影响国内外学者作了大量实验及研究，Slater M等[9]研究表明PRP促进有丝分裂和间充质干细胞的趋化性，能提高胎儿骨母细胞50倍的分化能力，并持续2个月。Kasten及其同事[10]发现同种异体的PRP能提高植有脱钙羟磷灰石桡骨骨缺损的愈合。Kroese-Deutman等[11]表明PRP对植有自体骨碎片兔子桡骨骨缺损有积极的刺激作用。Gandhi及其同事[12]应用治疗足、踝部骨折不愈和至少4个月的患者时，应用PRP联合自体骨植入不愈合处，结合标准治疗方法，他们观察到不愈合平均值减少到60天。Fennis等[13]认为，PRP促进骨缺损的修复机制可能是早期大量促进细胞增殖，增殖的细胞分化活性提高，在一定水平上进一步增殖分化促进骨折愈合。Marx等[14]推测，早期的PRP促进巨噬细胞的趋化，随时间的推移，骨缺损部位积聚大量巨噬细胞，分泌多种因子，代替PRP成为生长因子的主要来源，从而长期促进骨折愈合。在移植骨骨松质内的细胞膜上存在PDGF、TGF-β等因子的受体，加入PRP后，大量的生长因子促进成骨细胞，前成骨细胞的活化[15]。由于的生长因子在局部由于半衰期短、易降解、容易稀释等，不能在骨折处保持有效的浓度，为保证形成有效的浓度，就必须与载体复合使用，常用的载体有自体骨、人工骨、异体骨、异种骨等。有学者认为异种蛋白骨具有与人松质骨相似的形态结构，为血管生成，新骨形成提供良好的场所。另外，PRP有较强局部止血作用和促进创面修复愈合。研究还表明[16]PRP中的VEGF、PDGF等生长因子可以促进移植区的毛细血管生长和移植骨的再血管化，大量新生血管的形成为组织工程种子细胞提供丰富的营养，可促进骨缺损的修复。然而，由于对PRP 在细胞分子水平方面的研究还不深入，对PRP的作用出现了相反的报道。Cenni E等[17]最近研究证明，PAP影响破骨细胞的发展，并且在培养破骨细胞前体细胞时增加PRP的浓度，这种影响会加大。Ranly等[18]研究免疫缺陷裸鼠发现，PRP减少高成骨诱导性脱钙骨的成骨能力，而对对诱导性的骨基质没有影响。有实验也表明PRP在加快新骨形成同时，可促进植入骨吸收，但其具体效应及机制仍不明确[19]。Choi等[20]等研究也发现，加入PRP的实验组未显示能明显提高骨的再生能力。 Butcher A等[21]研究表明PRP混合某些骨替代材料(如，磷酸三钙)可能结果比单独使用PRP效果差。Weibrech及其同事[22]发现PRP在很低血小板浓度(270,000/mL)和很高浓度(2500，000/mL)时可能有抑制作用，但是浓度在100，000/mL时能起到积极作用。如果血小板的浓度不能维持，PRP可能导致有害的影响。在骨缺损区骨修复是一漫长过程，而血小板存活半衰期5～7d(生物学半衰期3d)。程文俊等[23]研究结论PRP在山羊体内的PRP有效作用时间5～7d，此后骨缺损修复将依赖于环境中成骨相关细胞的自分泌和旁分泌作用维持局部生长因子浓度。对于PRP并不能明显促进骨生长可能原因有，PRP对骨再生的作用有明显的时间及剂量依赖性;PRP中的转化生长因子与骨形态发生蛋白同源性;它们在受体上可能竞争，从而抑制了骨形态发生蛋白的活性，进而使具有成骨潜能的骨髓间充质细胞向骨及软骨细胞分化减少。4展望及当前存在的问题PRP目前主要集中动物实验的研究，在四肢骨缺损及大的骨缺损研究中尚缺乏实验数据。在不同时段分次给予PRP，使其提供的生长因子持续作用，对骨缺损愈合是否有促进作用，但缺少相应研究及报道。目前有关组织工程化新生骨组织中血液供应的重建研究还处于初步阶段，对于长管状组织工程化骨的快速建立血管化的技术尚待进一步研究。有些学者对PRP的治疗效果仍持怀疑态度，用自体骨做PRP载体修复骨缺损的疗效报道不一。此外，PRP的应用也有一定的禁忌，如血小板机能不良综合症、严重的血小板减少症、低纤维蛋白原血症等患者。在实验工作中我们还需要注意，PRP中血小板浓度、激活剂的类型以及制作时间等都可能影响PRP的生物学效果。各种生长因子在复杂的网络调节系统中相互之间如何调控至今尚不完全清楚，如何调控至今尚不完全清楚，以及生长因子是否会促进组织细胞异常增殖分化而导致癌变需要我们的研究。因此，PRP促进骨愈合的效果及机制需要更多的研究和证据来证明。【参考文献】[1]TE Foster，BL Puskas，BR Mandelbaum.Platelet-rich plasma From Basic Science to ClinicalApplications[J]. The American Journal of Sports Medicine,2009,37(11):2259-2272.[2]Eppley BL,Woodell JE,Higgin J. Platelet quantification and growth factor analysis from plateletrich plasma:implications for wound healing[J].Plast Reconstr Surg2004,114(6):1502-1508.[3]Marx RE,Carlson ER ，Eichstaedt RM ，et al.Platelet-rich plasma：Growth factor enhancement for bone grafts[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Rediol Endod,1998,85(6):638-646.[4]宋扬,宫苹.传统二次离心法和改良法制备富血小板血浆的比较研究[J].实用口腔医学杂志,2005,21(5):629-632.[5]Marx RE.Platelet rich plasma：evidence to support its use[J].J Oral Maxillofac Surg2004,62(4):489-496.[6]Everts PA,Knape JT,Weibrich G，et al. Platelet-rich plasma and platelet gel:a review[J].J Extra Corpor Techol2006,38(2):174-187.[7]Riedei K,Riedel F，Goessler UR,et al. Current status of genetic modulation of growth factors in wound repair[J].int J Mol Med2006,17(2):183-193.[8]Wagner W,Wehrmann M.Differential eytokine activity and morphology during wound healing in the neonatal and adult rat skin[J].J Cell Mol Med，2007,11(6):1342-1351.[9]Slater M，Patava K，Klingham K，et al. Involvement of platelets in stimulating osteogenic activity[J]. J Orthop Res,1995,13:655-663.[10]Kasten P，Vogel J，Geiger F，et al. The effect of platelet-rich plasma on healing in critical-size long-bone defects[J].Biomaterials,2008,29(29):3983-3992.[11]Kroese-Deutman HC，Vehof JW，Spauwen PH，et al. Orthotopic bone formation in titanium fiber mesh loaded with platelet-rich plasma and placed in segmental defects[J]. Int J Oral Maxillofac Implants,2008,37(6):542-549.[12]Gandhi A，Bibbo C，Pinzur M，et al. The role of platelet-rich plasma in foot and ankle surgery[J]. Foot Ankle Clin,2005,10(4):621-637.[13]Fennis JP，Stoelinga PJ，Jansen JA.Mandibular reconstruction：a histological and histomorphometric study on the use of autogenous scaffolds，particulate cortico-cancellous bone grafts and platelet rich plasnla in goats[J].Int J Oral Maxillofac Surg2004，33(1)：48-55.[14]Marx RE.Carlson ER，Eichstaedt RM，et al.Plateletrich plasma：Growth factor enhancement for bone grafts[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Rediol Endod1998，85(6):638-646.[15]Lucarelli E，Beccheroni A，Donati D，et al.Biomaterials[J]2003，24(18)：3095-31130.[16]Anitua E，Andia I,Sanchez M，et al.Autologous preparations rich in growth factors promote proliferaton and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture[J].Orthop Res2005,23(2):281-286.[17]Cenni E，Avnet S，Fotia C，et al. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood[J]. J Orthop Res,2010,28(6):792-797.[18]Ranly DM，Lohmann CH，Andreacchio D，et al. Platelet-rich plasma inhibits demineralized bone matrix-induced bone formation in nude mice[J]. J Bone Joint Surg,2007,89-A(1):139-147.[19]Fennis JP，Stoelinga PJ，Jansen JA. Mandibular reconstruction：a histological and histomor-phometric study on the use of autogenous scaffolds，particulate cortico-cancellous bone grafts and platelet rich plasma in goats[J].Int J Oral Maxillofac Surg2004,33(1):48-55.[20]Choi BH，Im CJ,Huh JY,etal.Effect of platelet-rich plasma on bone regeneration in autogenous bone graft[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2004,33(1):56-59.[21]Butcher A，Milner R，Ellis K，et al. Interaction of platelet-rich concentrate with bone graft materials：an in vitro study[J]. J Orthop Trauma,2009,23:195-200.[22]Weibrech G，Hansen T，Kleis W，et al. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration[J]. Bone,2004,34:665-671.[23]程文俊,金丹,赵艳,等. 富血小板血浆对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(4):386-389.