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　　【摘要】目的：探讨TWIST在膀胱癌组织中的表达情况，并分析其与临床病理特征及复发的关系。方法：膀胱尿路上皮癌标本65例，正常膀胱组织标本8例，采用免疫组织化学方法检测两组标本组织中TWIST蛋白的表达，并结合临床资料进行分析。结果：65例膀胱癌组织和8例正常膀胱组织中TWIST阳性率分别为69.2% (45/65)和0，TWIST蛋白在膀胱癌组织中的表达水平与患者的年龄、性别及肿瘤的数目无关( U 值分别为0.780、1.122、0.810，P>0.05)，但与膀胱癌组织的组织分化程度、肿瘤的分期以及复发具有显著相关性(U值分别为8.375、3.277、2.255，P<0.05)。随着膀胱癌细胞分化越差，浸润越深，TWIST蛋白染色阳性率逐渐上升，TWIST阳性率升高，提示复发风险增加。结论：TWIST蛋白表达在膀胱癌组织中明显高于正常组织，TWIST蛋白表达与膀胱癌的分级、分期、复发有关，与患者年龄、性别、肿瘤数目无相关性。检测TWIST蛋白有助于膀胱癌的诊断与预后的评估。

　　【关键词】 膀胱癌;TWIST;免疫组化;预后

　　[ABSTRACT] Objective：To explore the expression and significance of TWIST in bladder cancer， analyze its correlations with clinicopathologic characters and recurrence of bladder cancer. Methods：The expression of TWIST protein in 65 specimens of bladder cancer and 8 specimens of normal bladder tissues was detected by immunohistochemtry， and its correlations to clinicopathologic features was analyzed. Results：TWIST was detected in 59 cases(69.2%) of bladder cancer and zero in the normal bladder tissues. TWIST expression had no correlation with age，gender and the number of tumor ( U value were 0.780，1.122，0.810，P>0.05)，while it had significant correlation with degree of tumor differentiation， TMN stage and recurrence( U value were 8.375,3.277,2.255，P<0.05). The severe differentiation was and the deeper infiltration was，the higher positive expression of TWIST was. The increase of TWIST positive expression indicated higher rate of recurrence.Conclusions：The expression of TWIST protein was higher in bladder cancer patients. The positive rate of TWIST protein expression is related with tumor differentiation，TMN stage and recurrence，but not with sex，age，tumor number. The detection of TWIST protein expression is helpful in diagnosis and prognostic evaluation of bladder cancer.

　　[KEY WORDS] Bladder cancer;TWIST;Immunohistochemistry;Prognosis

　　TWIST是新近发现的凋亡抑制蛋白，属于碱性的螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白家族中高度保守的转录因子，在胚胎的发生和发展中发挥着重要作用。最近的研究表明，TWIST作为上皮-间叶细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中的关键调控因子，对肿瘤的侵袭和转移有重要影响。本研究采用免疫组化技术检测TWIST蛋白在膀胱癌组织中的表达，探讨其与膀胱癌临床病理因素之间的关系，为阐明膀胱癌侵袭转移的分子机制及其患者的预后提供依据。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料

　　本组膀胱尿路上皮癌组织65例，男性53例，女性12例，年龄30～80岁，中位年龄61岁。患者术前均未接受放、化疗(包括膀胱灌注)，且排除原位癌。收集资料包括肿瘤大小、数目、病理分级、分期(依据AJCC 2002标准)、复发情况等。正常膀胱组织8例，均经病理证实。

　　1.2　试剂

　　TWIST鼠抗人单克隆抗体(H-81， SC15393)购自Santa Cruz公司，免疫组化染色试剂(SP9002)、DAB显色液(ZLI-9033)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3　检测方法

　　采用S-P免疫组化法。石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，pH9.0的EDTA缓冲液中经高压锅抗原修复，加入10%的胎牛血清37℃孵育，加TWIST单克隆抗体(1∶200稀释)4℃过夜。加生物素标记二抗37℃孵育，辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育，DAB染色，苏木素复染。用PBS代替一抗做空白对照。

　　1.4　结果判断标准

　　TWIST蛋白主要表达于细胞质中，少数细胞核中亦有表达。以细胞呈清晰棕色或棕褐色为阳性，以细胞无棕褐色或与背景一致极淡的棕色为阴性。在40倍显微镜下观察整张切片表达情况，选择表达最集中的5个视野，换高倍镜计数阳性细胞，计算平均数。按阳性细胞占总细胞数的比例分级：<5%为-，5%～25%为+,25%～50%为++，>50%为+++。-为阴性，+为低表达，++～+++为高表达。

　　1.5　统计学处理

　　应用SPSS 13.0统计软件处理数据。TWIST的表达与各临床病理因素之间的关系分别采用Radit分析和χ2检验。生存过程描述采用Kaplan-Meier生存曲线法，并进行Log-rank检验。

　　2　结果

　　2.1　TWIST在膀胱癌组织和正常组织中的表达

　　膀胱癌组织中TWIST阳性染色主要位于胞质中(图1、2);65例膀胱癌组织中45例染色阳性，其中+24例，++15例，+++6例，阴性染色20例，阳性率为69.2%,8例膀胱正常黏膜组织中无表达，肿瘤组织中的表达明显高于正常膀胱组织(χ2=14.440，P<0.01)。　图1　TWIST在正常组织中　图2　TWIST在膀胱癌细未见表达胞质中的表达

　　2.2　TWIST蛋白的表达与膀胱癌临床参数之间的关系

　　TWIST蛋白在膀胱癌组织中的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤的数目无关(U值分别为0.780、1.122、0.810，P>0.05)，但与膀胱癌组织的分级、分期以及患者的复发情况具有显著相关性(U值分别为8.375、3.277、2.255，P<0.05)。随着膀胱癌组织浸润深度的加深，TWIST蛋白染色阳性率逐渐上升，TWIST阳性率随5年复发率升高而升高，见表1。表1　TWIST在膀胱癌中的表达与膀胱癌患者临床、病理参数之间的关系

　　2.3　Kaplan-Meier单变量生存分析

　　TWIST蛋白表达阳性膀胱癌组织复发率较阴性组高(Log-rank检验，χ2=4.157，P=0.041)， TWIST蛋白阳性提示复发风险高，见图3。图3　TWIST蛋白阴性组与TWIST蛋白阳性组表达的Kaplan-Meier生存曲线

　　3　讨论

　　TWIST基因是一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，属于螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子家族，可调节胚胎发育过程中的细胞重建，并赋予细胞迁移的能力。TWIST在幼稚中胚层细胞和中胚层起源器官中表达最多，而在出生后降至低水平。新近发现TWIST具有癌基因的特征，能编码凋亡抑制蛋白。在浸润性乳腺癌(浸润性小叶癌)、弥漫性胃癌等恶性程度高、浸润性强的肿瘤亚型中可见TWIST表达，但其表达强度较幼稚中胚层细胞和中层起源器官中表达为弱，但在正常组织和恶性程度低的癌细胞中并无表达[1]。一些学者因此推测TWIST的激活可能是某些恶性肿瘤发生、发展和转移的重要因素。

　　TWIST与EMT现象及肿瘤转移密切相关[2]。TWIST促进肿瘤细胞侵袭转移的主要机制在于其能够使细胞失去上皮性标志如E-钙粘连蛋白(E-cadherin)，而获得间质细胞的标志如波形蛋白(vimetin)和平滑肌肌动蛋白等[3,4]，这使得肿瘤细胞容易脱离原发病灶向周围组织侵袭，并为肿瘤的远处转移提供了必要的条件。在绝大多数恶性肿瘤中，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮肤癌及肺癌等都存在E-cadherin介导的细胞-细胞黏附功能的削弱或丧失[3-7]，其共同特征是含有能识别靶基因启动子上E-box基序的DNA结合序列[8]。随着对TWIST研究的深入，TWIST的激活有可能作为肿瘤的预后因素或者作为肿瘤治疗的靶分子[9,10]。

　　本研究发现，膀胱癌组织中TWIST蛋白的表达水平明显高于正常膀胱黏膜组织(P<0.01)，提示TWIST蛋白可为膀胱癌与非癌的鉴别提供参考;同时发现，膀胱癌细胞分化越差，浸润越深， TWIST蛋白阳性细胞数越多，染色越深。肌层浸润性膀胱癌中TWIST表达明显高于非肌层浸润性膀胱癌，提示TWIST在膀胱癌的进展中起一定作用。因此，临床通过检测TWIST蛋白的表达，有助于非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的鉴别诊断。本研究结果还提示，TWIST蛋白高表达与患者的术后复发有关，为临床患者术后复发提供了生物学指标。这与刘婷等[11] 对胃癌的研究结果相同。

　　综上所述，TWIST蛋白表达与膀胱癌的病理分级、分期成正相关，而且TWIST蛋白的表达也是预测患者术后复发的一个有效指标。TWIST参与膀胱癌的发生、浸润、复发和预后的机制及其与其他相关基因的关系如何，是进一步研究的重点。

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　　10　Puisieux A，Valsesia-Wittmann S，Ansieau S，et al.A TWIST for survival and cancer progression[J].Br J Cancer,2006,94 (1)：13-17.

　　11　　刘婷，耿敬姝，冯美燕.TWIST蛋白在胃癌中的表达及其意义[J].实用肿瘤学杂志，2008,22(1)：14-16.