单核细胞趋化蛋白1和血管内皮细胞生长因子在人皮肤血管瘤

　　作者：徐圣康,赵,猛,刘家国,张劲松　　作者单位：郧阳医学院附属太和医院创伤骨科,湖北 十堰 442000

　　【摘要】目的:探讨单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在人皮肤血管瘤发生、发展及退化过程中的表达及其相关性。方法：采用免疫组化方法(SP法)和计算机图像分析技术，检测人皮肤血管瘤增生期、消退期及正常皮肤中的MCP1、VEGF的平均阳性面积率和平均光密度。结果：增生期血管瘤与消退期血管瘤、正常皮肤组分别相比，MCP1、VEGF阳性表达的平均光密度和平均阳性面积率有显著性差异(P<0.05);消退期血管瘤与正常皮肤组之间，MCP1、VEGF阳性表达率无显著性差异(P>0.05);MCP1、VEGF阳性面积表达率呈明显的正相关(r=0.746,P<0.05)。结论：MCP1、VEGF在人皮肤血管瘤过度增生中起着重要的作用，且二者之间可能具有相互协同作用。

　　【关键词】 MCP1;VEGF;血管瘤;血管生成;免疫组化

　　The Correlation between Monocyte Chemoattractant Protein1 and Vascular Endothelial Cell Growth Factor Expression in Skin Hemangioma Tissue XU Shengkang1,ZHAO Meng1*，LIU Jiaguo1，ZHANG Jinsong1，WANG Yurong2 (1Department of Orthopaedic Trauma，Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China; 2Department of Plastic Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan,Hubei 430022，China)

　　Abstract: Objective To explore the expression of monocyte chemoattractant protein-1(MCP1) and vascular endothelial cell growth factor(VEGF) in hemangioma and the relationship between MCPl and VEGF.Method:MCPl and VEGF expression in 36 cases with hemangioma were detected with immunohistochemistry.The average optical density and the positive area of MCP1 and VEGF expression in specimens with different stage hemangioma were analyzed with image analysis.Results: Compared regression stage of hemangioma or normal skin tissues，MCPl and VEGF protein expression was significantly higher in proliferative hemangioma(P<0.05).There was no statistically significant difference in MCPl and VEGF expression between regression stage of hemangioma and normal skin tissues (P>0.05).There was a positive correlation between MCP1 and VEGF in the proliferative hemangioma(r=0.746,P<0.05).Conclusion: These results suggest that MCPl and VEGF play an important role in abnormal angiogenesis of capillary endothelial cells,during the development of hemangioma.

　　Key words: Monocyte chemoattractant protein1;Vascular endothelial cell growth factor;Hemangioma;Angiogenesis;Immunohistochemistry

　　血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，发病率约为1%～3%[1]，好发于头面颈部及四肢等体表部位。血管瘤逐渐增大，会造成面部、四肢严重畸形，甚至危及生命，但目前关于血管瘤的增殖退化机制仍不完全清楚。

　　单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein1,MCP1)是最近被确认的具有趋化及活化单核巨噬细胞作用的一种趋化细胞因子，在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用[2]，近年来在肾脏病、恶性肿瘤及动脉粥样硬化中研究较多，同时发现其在血管形成中起着重要作用。血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)是一种己知的重要的调节血管再生的细胞因子，与血管内皮细胞的增殖、新生血管的形成密切相关。

　　为探讨MCP1和VEGF在人皮肤血管瘤中的表达及其相互关系，本研究采用免疫组化方法(SP法)分析它们在人皮肤血管瘤组织中的表达，并利用计算机图像分析技术对其进行分析，初步探讨其在血管瘤中的作用机制及其相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　本试验材料均来自华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科和湖北省郧阳医学院附属太和医院病理科1997年7月-2006年5月皮肤血管瘤存档蜡块36例，其中男20例，女16例，最小年龄2个月，最大69岁，平均年龄34.6岁。部位有头面部、耳垂、颈胸部、背部、上臂、手足皮肤及鼻腔粘膜。所有患者手术前未行任何治疗，患处手术未感染，标本均经病理证实。实验标本根据其镜下结构特点进行分期，组织内20%以上部位有纤维或脂肪浸染或有血管腔闭塞者为消退期，无上述组织结构改变者为增生期。正常皮肤来源取自于清洁手术的自愿者。

　　1.2 试剂

　　兔抗人MCPl多克隆抗体和兔抗人VEGF多克隆抗体(进口分装)均购于北京中杉金桥生物试剂有限公司。

　　1.3 实验方法

　　5 μm厚石蜡切片常规脱蜡至水; 3%H2O2封闭15 min，微波抗原修复，分别滴加一抗MCP1(1∶150)、VEGF(1∶100), 4 ℃过夜后，生物素标记的二抗、37 ℃孵育10 min，再加链霉素-抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min;DAB显色，苏木素浅染，封片。同时PBS代替一抗做阴性对照，正常皮肤作为MCP1的对照。以上步骤均严格按照说明书进行操作，严格控制时间及温度，每次染色均设阴性对照。

　　1.4 组织学观察

　　MCP1表达以细胞核或胞浆中有棕黄色颗粒为阳性，无反应为阴性;VEGF表达以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。阴性对照组除细胞核染成蓝色以外，无棕黄色反应颗粒。HMIAS2000型自动医学彩色图像分析系统进行图像分析，平均光密度值及平均阳性面积率表示细胞化学反应强度量的变化。每例标本选3张切片，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应细胞的面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例15个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

　　1.5 统计学方法

　　所有数据以均数±标准差(x±s)表示，将血管瘤增生期、消退期阳性反应的平均光密度、平均阳性面积率作方差分析和 SNK 检验(q检验)，MCP1表达与VEGF表达相关性采用Spearman等级相关分析，所有数据均在SPSS12.0软件上进行，P<0.05为差异具有显著性。

　　2 结果

　　2.1 组织学分期

　　根据Mulliken分类法及组织学观察，36例标本中，增生期血管瘤22例，该期血管瘤组织中内皮细胞增生密集，有些形成血管腔，有些则呈团块状，免疫组织化学反应出现密集的棕黄色颗粒(图1)。消退期血管瘤14例，该期组织中内皮细胞减少，基本无管腔或血管腔增大，血管间结缔组织增多，免疫组织化学反应出现少量棕黄色颗粒或无反应(图2)。对照组及正常皮肤组织基本无染色。

　　2.2 VEGF表达

　　增生期血管瘤组织中有VEGF表达，免疫组织化学阳性反应为棕黄色颗粒，见于已出现血管腔的内皮细胞和尚未出现血管腔的内皮细胞胞浆中(图3)，而在血管瘤消退期和正常皮肤中表达极弱，有的无表达(图4)。

　　2.3 MCP1表达

　　MCP1阳性表达见细胞胞质呈棕黄色颗粒状染色。增生期血管瘤内皮细胞胞浆和胞质内均可见深染的棕黄色颗粒状MCP1表达产物，胞浆内着色很深，光密度值较高，提示有MCP1的高表达(图5);而阴性对照组细胞胞浆内基本不着色，光密度值较低，提示基本没有MCP1合成(图6)。消退期血管瘤及正常皮肤中MCP1表达较少，甚至没有表达。(图7～8)

　　经单因素方差分析，增生期血管瘤与消退期血管瘤及正常皮肤对照组比较，增生期血管瘤MCP1与VEGF的表达显著增高(P<0.05)。经q检验,增生期与消退期、增生期与正常皮肤之间,MCP1与VEGF平均光密度及平均阳性面积率的差异均有显著性意义(P<0.05)。消退期与正常皮肤MCP1与VEGF的表达，差异无显著性意义(P>0.05)，见表1～2。表1 血管瘤不同时期MCP1和VEGF抗原 表达的平均光密度注：增生期血管瘤与消退血管瘤比较,▲P<0.05;增生期血管瘤和正常皮肤比较,△P<0.05;消退期血管瘤与正常皮肤比较,☆P>0.05表2 血管瘤不同时期MCP1和VEGF抗原表达的平均阳性面积率注：增生期血管瘤与消退期血管瘤比较,▲P<0.05;增生期血管瘤和正常皮肤比较,△P<0.05;消退期血管瘤与正常皮肤比较,☆P>0.05

　　2.4 MCP1表达与VEGF表达

　　经Spearman等级相关分析，血管瘤组织中VEGF和MCP1的阳性细胞表达率呈明显的正相关(r=0.746，P<0.05)。

　　3 讨论

　　血管瘤是一种血管增生性疾病，内皮细胞增殖是血管瘤的显著特征。血管瘤在许多情况下具有恶性进程的特点，但某些血管瘤也可自然消退。目前尚无确切的判断血管瘤能否自然消退的指标。血管瘤增殖退化相关因子目前研究较多。

　　VEGF是一种己知的重要的调节血管再生的细胞因子[3]。VEGF的主要生物学特性是增加血管通透性和促进内皮细胞增殖、新生血管形成。VEGF通过与细胞膜上表达的VEGF受体相联接来发挥作用。目前己知VEGF有多种受体，Flt1(fmslike tyrosine kinase1)和KDR/Flk1(kinaseinsert domain containing receptor/fetal liver kinase1)是2种研究得最多且较重要的受体，其基因分别定位于染色体13q12和4q12，两种受体均能与VEGF发生特异性的高亲和力的结合，但二者的作用不尽相同。相关研究表明，KDR与血管形成和造血有关，Flt1在内皮细胞排列形成管腔时发挥主要作用。在细胞内信号传导途径上，KDR通过PKC(蛋白激酶C)介导的通路促进血管内皮细胞DNA合成;Flt1则通过激活P38 MAP激酶间接造成肌动蛋白的重组来促进血管内皮细胞的迁移。鉴于VEGF及其受体在肿瘤生长中的重要性，针对VEGF及其受体的抗肿瘤治疗也逐渐展开，但尚处于实验阶段[4]。己证实VEGF在组织中的表达反映了该组织的血管生成活性[5]。本研究中VEGF在增生期血管瘤内皮细胞中高表达，在消退期血管瘤及正常皮肤中低表达，甚至无表达，说明VEGF参与了血管瘤的血管形成，并促进了血管瘤的生长，抑制血管瘤的消退。由于VEGF具有强烈的促进内皮细胞增殖和血管形成的作用，血管瘤的血管内皮细胞中VEGF受体的表达增强可能是血管瘤形成的因素之一。

　　MCP1是化学介质CC家族的成员，具有趋化单核细胞和T淋巴细胞聚集并激活单核细胞和巨噬细胞的作用，是参与炎症形成的重要因子[6]。在血管形成方面，MCP1能诱导单核细胞、血管内皮细胞表达黏附分子，从而增加粒细胞的黏附，导致血管闭塞、微血栓形成及发生进一步血管损伤。MCP1参与多种病理、生理过程，就其对血管瘤的作用而言，它可能通过2个方面发挥血管生成作用[7]：⑴MCP1可以直接促进血管生成。在许多炎性疾病中，如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，这些疾病的显著特点就是有较多的血管生成，而且MCP1呈高的表达;Salcedo[8]等应用鼠主动脉环在无炎性存在的情况下进行细胞培养，结果发现：MCP1可以刺激大量的毛细血管增生，显示了MCP1在血管生成中的直接作用。Gordillo等[1]在血管瘤大鼠模型的研究中发现MCP1能募集巨噬细胞，诱导表达I型胶原蛋白，促进血管生成，进一步研究发现MCP1受体拮抗剂可显著改善人皮肤血管瘤的发生发展 。⑵MCP1通过血管瘤内浸润的巨噬细胞，即所谓肿瘤相关巨噬细胞(Tumorassociated macrophages，TAMs)聚集、迁徙而发挥间接的血管生成作用[9]。巨噬细胞浸润是血管瘤的显著特征。TAMs是血管瘤间质的一个主要成分，可能在血管瘤的生长和转移中起着重要作用。TAMs浸润进入血管瘤被许多细胞素和化学介质调节，MCP1是主要的调节剂。TAMs计数与微血管计数正相关，TAMs可以分泌细胞素如VEGF、VEGFC，提示MCP1在血管生成中的间接作用，可能通过诱导VEGF的生成促进血管形成。Salcedo[8]报道MCP1在微摩尔浓度水平就能趋化血管内皮细胞，促进局部组织细胞表达VEGF并诱导血管生成。本试验中MCP1在增生期血管瘤中大量表达，在消退期血管瘤和正常皮肤中表达弱甚至无表达也说明了其在血管生成中具有重要作用。同时本试验发现增生期血管瘤中MCP1与VEGF阳性细胞表达率呈正相关，MCP1与VEGF有协同促进血管瘤血管生成的作用，可能通过刺激VEGF的分泌来实现对血管诱导和生成的作用。

　　综上所述, MCP1在人皮肤血管瘤组织中的表达与血管内皮细胞增殖的发生密不可分，MCP1作为一种重要的化学趋化因子，在血管瘤及其他疾病中可以诱导VEGF的产生，进而介导了炎症反应的发生，促进血管的形成和发展，在血管瘤血管生成过程中发挥着重要的作用，但MCP1的作用机制尚需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Gordillo GM,Onat D,Stockinger M,et al.A key angiogenic role of monocyte chemoattractant protein1 in hemangioendothelioma proliferation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2004，287(4):C866-873.

　　[2]Ueno T,Toi M,Saji H，et al.Significance of macrophage chemoattractant protein1 in macrophage recruitment,angiogenesis,and survival in human breast cancer[J].Clinical Cancer Research,2000,6(8)：3 282-3 289.

　　[3]胡 毅，关桂梅，孔祥波，等.MCP1和VEGF在膀胱癌中表达的相关性及其意义[J].中国实验诊断学，2006,l0(5)：490-492.

　　[4] Isik FF,Rand RP,Gruss JS，et al.Monocyte chemoattractant protein1 mRNA expression in hemangiomas and vascular malformations[J].J Surg Res,1996,61(1):71-76.

　　[5]郑 翔，涂汉军，李新建,等.冷冻对小鼠G422胶质瘤血管生成及VEGF表达的实验研究[J].郧阳医学院学报,2001,20(2):65-67.

　　[6]Salcedo R,Ponce ML,Young HA,et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP1:direct role of MCP1 in angiogenesis and tumor progression[J].Blood,2000,96(1):34-40.

　　[7]Schlondorff D,Nelson PJ,Luckow B,et al.Chemokines and renal disease[J].Kidney Int,1997,51(3):610-621.

　　[8]Salcedo R,Ponce ML,Young HA，et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP1:direct role of MCP1 in angiogenesis and tumor progression[J].Blood，2000,96(1):34-40.

　　[9]冯红超，宋宇峰，温玉明.口腔鳞癌中VEGF表达和肿瘤相关巨噬细胞在血管生成作用中相互作用的初步研究[J].中国肿瘤临床,2004,31(8)：435-437