软骨组织工程种子细胞的选择

　　作者：熊熠,林月秋,申财芳　　作者单位：昆明，昆明医学院临床学院，成都军区昆明总医院骨科 (熊　熠、林月秋、申财芳)

　　【关键词】 关节软骨组织;工程种子细胞;研究进展

　　关节软骨自身修复能力较差，无血液供应、神经组织和淋巴回流，因此未达到软骨下骨的软骨内损伤几乎不能愈合，只在伤口周围产生短暂的软骨细胞复制并合成少量基质，且逐渐引起关节表面退变[1]。关节软骨全层损伤往往并发软骨下骨损伤，骨坏死后期因关节面塌陷可致关节软骨结构破坏，因此长骨干骺端病损无论原发于关节软骨或骨，到后期均表现为骨软骨同时破坏，目前对这种软骨合并软骨下骨损伤的治疗困难，传统的治疗方法不能取得满意的效果。运用组织工程方法修复关节软骨缺损展示了令人鼓舞的前景。关节软骨组织工程是通过生物学和工程学的原理和方法构建具有生物活性的软骨组织，用以修复、改善关节软骨缺损，加快关节功能的恢复。通过体外获取并大量增殖软骨种子细胞，种子细胞来源广泛、可大量生产并可任意塑形的生物材料上，在体外构建成为软骨细胞.形成三维支架复合物，进而植入体内修复各种关节软骨缺损。因此可靠而安全的软骨种子细胞来源是保证软骨组织工程持续深入研究的前提。本文介绍了目前软骨组织工程种子细胞来源、培养和评价等方面的最新研究进展。

　　1　软骨细胞

　　1.1　自体软骨细胞

　　理论上讲自体软骨细胞是软骨组织工程最理想的种子细胞源，不仅功能相同，不存在免疫排斥反应，而且不需要诱导分化培养。软骨细胞是终末分化细胞，可以合成ECM，如Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合物等，是关节软骨组织工程研究中最早应用的软骨种子细胞。 1987年在瑞典开展了首例自体软骨细胞移植术修复膝关节软骨。至2005年国外关于自体软骨细胞移植的临床研究共计61项，累积人选病例3987人次[3]。Pterson等[4]人取37例自体软骨细胞移植术2～9年后的再生软骨组织进行活检，发现15例再生组织类似透明软骨。MRI评估软骨细胞源性软骨工程提示关节软骨修复疗效良好[5]。因此，通过临床证实，对于大部分关节软骨损伤患者，自体软骨细胞移植治疗关节软骨缺损是有效的。但是，软骨细胞是分化能力极弱的终末细胞，经过一段时间(一般是4代)传代培养后，细胞表型易发生变异，表达的Ⅱ型胶原蛋白会变为I型胶原蛋白，且生长缓慢，不能达到组织工程软骨的需要数量。因该细胞取自患者来源有限、对个体造成二次创伤、增加了手术费用和患者痛苦等。而且，自体软骨组织取材小难以达到应有的细胞数量，体外培养扩增细胞易发生“去分化”而失去原有的特征口。取材大势必造成再损伤，一般情况下需要修复的软骨组织已处于病损状态，难以承受再损伤或根本无法获得自体软骨组织，限制了其应用。

　　1.2　异种和同种异体软骨细胞

　　异种软骨细胞来源充足，短时间可大量获取、增殖，但植入受体后免疫排斥反应严重，故应用较少。同种异体软骨细胞来源于非患者的其他个体关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨及耳软骨等。虽然该类种子细胞也存在免疫反应，但随着移植时间推移其免疫反应逐渐减弱，并且随着免疫抑制剂研究的快速发展，较严重的免疫反应已基本消除。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛，取材容易，一次可获取大量细胞，并且在三维培养环境和或生长因子作用下，可保持软骨细胞的化学特性[6]。1968年，Chestrman和smith第一次报道同种异体软骨细胞移植治疗关节软骨损伤以来，先后有多位学者尝试应用同种异体软骨细胞移植治疗关节软骨损伤，然而，最初同种异体软骨细胞移植成活率不足40%，后来Wakitani选择胶原为载体，结合异体细胞修复软骨缺损，使得同种异体软骨细胞成活率提高到80%。然而，该软骨细胞来源于其他健康个体，在获取的同时又对其他个体造成创伤，增加二次手术费用，故也不是最理想的软骨种子细胞来源。

　　2　干细胞

　　2.1　骨髓间充质干细胞

　　1976年，Friedenstein将利用骨髓贴壁培养的方法分离的具有多向分化的细胞命名为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)o目前，用于BMSCs分离的方法主要有：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法[7]。但目前方法分离得到的BMSCs，BMSCs在诱导因子作用下可向软骨细胞分化，已被公认有可能成为关节软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前，国内外BMSCs定向诱导为软骨细胞的方式很多，大体可分为体外和体内两种诱导方式。体外诱导包括体外细胞团聚集诱导、体外单层细胞团诱导、体外三维支架环境中诱导与软骨细胞体外共培养诱导。体内诱导包括体内软骨微环境诱导和基因转染诱导。但是BMSCs应用于软骨组织工程中仍然存在一些问题，wakitani等采用体外培养的兔自体BMSCs修复关节软骨全层缺损后，组织学评分发现术后3个月内缺损被软骨组织所修复，其后他们又进行了人关节软骨缺损的修复，也获得类似效果。但经长期观察发现，已形成的透明软骨最终被纤维软骨和骨样组织所代替[8]。并且，由于BMSCs具有多向分化的潜能，故干细胞中只有一小部分能自发地分化为软骨祖细胞，其在体外的分化很大程度上依赖于特殊的培养条件，诱导因子在BMSCs的定向分化中起到非常关键的作用 。但其纯化率较低且干细胞数量有限，因而不能满足实验及临床应用的需求;如何高质量地修复软骨缺损并获得很好远期疗效及如何让调控BMSCs定向分化为成熟软骨细胞仍然是其大规模应用于临床的首要问题。另外，取材时对机体的创伤较大，有取材点的疼痛;也限制了其在临床的应用。

　　2.2　脂肪干细胞

　　1974年，有学者首先从脂肪组织中分离出可以在含有甲基纤维素的培养基中单层培养或悬浮培养的能将聚集甘油三酯转化成为脂肪细胞的细胞[9] 。随后，一些学者将来源于成人和小鼠的脂肪组织经过胶原酶消化之后，在诱导培养基中形成了成熟的脂肪细胞，且对照组采用成纤维细胞而无此现象，于是他们将此细胞定义为脂肪祖细胞，但未对此细胞进行多向分化能力的检测[10]，2001年，才有学者从脂肪组织中分离出具有多潜能分化的细胞，并首次定义为脂肪干细胞。众多研究表明，ADSCs有很强的多向分化能力，可在不同的培养基中诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞和心肌细胞等。有研究表明，ADSCs和BMSC的组织学

　　特征、细胞表型和多向分化能力等方面没有明显的差别，仅CD抗原略有不同，这就说明ADSCs完全可以替代BMSC在软骨组织工程中的作用，ADSCs有很多优点：1)细胞贴壁能力强，体外易于培养;2)营养需求低，在培养基中生长旺盛;3)体外倍增时间为16h,48h可传代，优于同步培养的BMSCs;4)脂肪组织中干细胞含量丰富，平均为每升2xlOs个脂肪细胞，可获得足够的细胞量以满足实验及临床应用的需要;5)BMSCs在体外长期培养时对血清有较高的选择性，需要地塞米松等添加物，而ADSCs在体外培养对血清无特殊的选择性，无需添加物就可良好生长。而且在体外增殖多代之后仍具有完好的细胞特异性标志，并继续保持分化的能力，此外，脂肪干细胞还具有易取材，细胞贴壁能力强，营养要求低，现在随着肥胖人口的增多，它几乎是无止境的细胞来源库，但是ADSCs仍然有很多不足之处。例如在干细胞的纯化及从实验室的动物研究走向人体应用等方面，更重要的是，尽管脂肪源性干细胞具备软骨形成能力，但与其他干细胞相比，脂肪源性干细胞的软骨特异性基质蛋白和II型胶原的表达较低。因此，软骨形成潜能的较低，干细胞的纯化问题有待进一步解决。另外，目前脂肪干细胞的研究工作大多集中于体外实验，是否能真正运用于临床工作中还需进一步考证。

　　综上所述，尽管ADSCs在软骨组织工程修复方面有很多优势，但其不足之处也限制了ADSCs在种子细胞方面的应用。

　　2.3　胚胎干细胞

　　胚胎干细胞(embryonic stem cell)是胚胎发育早期胚泡内细胞团中未分化的细胞，具有以下特点：① 具有受精卵的某些特性，可多向分化、无限增殖，可以分化成胎儿和成体内各种类型的组织细胞;②可以在体外增殖并保持未分化二倍体的状态，具有全能性和形成嵌合体动物的能力;③可以在体外培养条件下建立稳定的细胞系，长期培养并保持高度未分化状态和发育潜能性[7]。因此胚胎干细胞有望成为软骨组织工程中新的种子细胞的理想来源。1981年，英国学者Evans等和美国学者Mart等分别成功地分离和体外培养了小鼠的ESCs。1995年美国学者Thomson等L5 从猴的囊胚中首次建立了灵长类动物的ESCs系。1998年，他们从体外人工受精的内细胞团中分离获得了人ESCsL6J。2000年，澳州学者Reubinoff等从人囊胚中成功地建立了两株未分化人ESCs系，并且在体外成功地得到神经祖细胞。其他由ESCs通过诱导分化而获取的目的细胞，如骨细胞 、脂肪细胞 和胰岛细胞[Do]等也已有报道。采用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和BMP-4作为调控诱导因子，在体外也成功地诱导ESCs分化为软骨细胞，透射出从ESCs获取软骨种子细胞的希望曙光[11]。胚胎干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比，除具有更强的增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，因而胚胎干细胞作为种子细胞可能更为优势。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞，体外培养要求严格，自发分化难以控制，分化多具致瘤性，安全性难于把握，临床使用尚存在伦理学问题[12]。

　　3　滑膜细胞

　　滑膜细胞也是软骨组织工程的候选细胞。关节膜层有大的组织表面，在关节内并直接与软骨接触，如果选用合适的基因转染滑膜细胞，其分泌的转基因产物可通过滑液渗入软骨从而影响软骨细胞的代谢，或作用于组织工程软骨中的种子细胞，使其定向分化为软骨细胞[13]。B型滑膜细胞由胚胎时期的原始关节间区的间充质细胞分化而来，近年采的研究显示，B型滑膜细胞具有成软骨的能力。应用基因强化方法将转化生长因子B1基因转染到B型滑膜细胞，可成功促进其向软骨细胞分化，并可保持软骨细胞表型迭3周以上，支架材料的选择是软骨组织工程研究的重要因素，Pluronic F.127是由70%的聚氧化乙烯和30%的聚氧化丙烯构成的共聚物，具有良好的组织相容性，可以很好的支持种子细胞的形态和功能的发挥 实验将转染后的阳性克隆细胞与Pluronic F-127混合，在裸鼠体内构建组织工程软骨，进一步研究B型滑膜细胞作为组织工程种子细胞的可行性，为软骨组织工程提供新的方法[14]。

　　4　软骨膜细胞或骨膜细胞

　　骨膜和软骨膜生发层含未分化的间充质细胞，在低氧张力、无血供的关节腔内分化为软骨细胞、关节滑液和使用CPM是促使间充质细胞向软骨细胞分化的有利因素。Wakitani等培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Chu等 用异体肋软骨膜细胞和PLA支架修复兔股骨髁软骨缺损，96% 的缺损6周时为软骨填充，Ⅱ型胶原比例随时间延长而升高，说明关节内环境刺激新生组织向透明软骨方向发展，黏多糖含量12个月时降低，软骨下骨厚度为正常的50%，认为异体移植的免疫反应和PLA降解产物的酸性环境影响了软骨下骨结构的形成，导致新生软骨生物力学性能下降和纤维化。

　　5　其他种子细胞

　　最近，Pufe等报道了人类外周血中的程序性单核细胞源细胞具有生成II型胶原产生软骨细胞的潜能。Choi等 驯发现人脐带源性多系祖细胞在胶原凝胶的三维培养中可以分化形成软骨细胞。Degistirici等 将骨髓血中的非限制性体干细胞用于软骨缺损的修复的研究[15]。

　　6　展　望

　　种子细胞是构建组织工程化软骨和应用研究中的首要环节和基本要求，也是保证软骨组织工程学持续性深入研究的前提。影响优化软骨种子细胞源的因素众多，目前研究的种子细胞各具优缺点，尚没有一种细胞能够完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，今后需要开发和挖掘更多的种子细胞源，并在模拟体内的微环境中进行培养，建立种子细胞的评价系统，优化出理想的种子细胞，为软骨组织工程的研究和临床应用提供可靠保证[12]。需要注意的是当前组织工程化软骨仍处于实验室研究阶段，如种子细胞的改造、种子细胞培养扩增技术的成熟，如何延长细胞的寿命、降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受等，目前研究大多停留在实验研究阶段，距离软骨组织工程临床应用尚有一定距离。但是可以预见的是，随着生命科学的发展和细胞培养技术的不断提高，软骨组织工程将在不远的将来广泛应用于临床。

　　【参考文献】

　　[1]　何　森，张其清.关节软骨组织工程的研究进展[J].国际生物医学工程杂志，2007,30(4)：249-351,1505-1507.

　　[2]　Jakobsen RB Engebretsen L.Slauterbeck JR.An analysis of the quality of Cartilage repair studies[J].J Bone Joint Surg Am,2005,87：2239.

　　[3]　Peterson L，Minas T，Brittberg M，et al.Two to 9 Year outcome after autologous choudrocyte transplantation of the knee[J].Clin Orthop,2000,374：212-234.

　　[4]　LangP，Noorbakhsh F，Yoshioka H.MR imaging of articular cartilage：current state and recent developments[J].radiol Clin North Am,2005,43：629-639.

　　[5]　 Butnariu2Eph rat M，Robinson D，M endes DG，et al.Resurfacing of goat articular cart ilage by chondrocytes derived from bone marrow[J].Clin O rthop,1996,330： 234.

　　[6]　朱　鹫，吴玉家，江　华.干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究进展[J].中国美容整形外科杂志，2008,19(1)： 60-61.

　　[7]　张　玲，陈长永.骨髓问充质干细胞在软骨组织工程化组织构建中的应用[J].中国美容医学，2009 18(2)： 275-277.

　　[8]　Green H，Meuth M[J].Cell,1974,3(2)：127-133.

　　[9]　Pettersson P，Cigolini M，Sjoestroem L，et al[J].Acta MedScand.1984,215(5)：447-451.

　　[10] 孙安科，裴国献.软骨组织工程种子细胞的来源、培养和评价[J].国外医学生物医学工程分册[J].2003,26(4)： 179-183 .

　　[11] 王翠芳，冯万文，武天佑.软骨组织工程种子细胞源的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2009,14(6)：441-443.

　　[12] 于　娟，闫玉华，万　涛.软骨组织工程研究进展[J].生物骨科材料与临床研究，2005,2(3)： 31-35.

　　[13] 李卫平.软骨组织工程中种子细胞的应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2009,46(9)： 9055-9060.

　　[14] 刘擢升，刘蜀彬.软骨组织工程研究中的干细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2009,13(7)：1334-1337.

　　[15] 李景红，杜　江，黄金中.软骨组织工程种子细胞来源的最新研究进展[J].中国临床康复，2003,7(23)：3240-3241.