脊髓损伤新型神经细胞支架材料研究进展

　　作者：王仙凤,蒋丹,陈果,张晓,杨拯,陈建敏　　作者单位：成都医学院04级临床本科班;成都医学院06级临床本科班;成都医学院实验技术中心，成都 610083

　　【关键词】 脊髓损伤;支架材料

　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是临床上有严重危害的急性病损。目前脊髓损伤修复研究的主要方向是利用组织工程和神经干细胞修复损伤脊髓。方法是将一定量的细胞种植到具有一定结构的三维支架上，然后将此细胞-支架复合物植入体内或体外继续培养，通过细胞间的相互粘附，增殖和分化，分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官，达到修复损伤脊髓的目的。

　　1 脊髓损伤新型神经细胞支架材料及材料要求

　　1.1 脊髓损伤新型神经细胞支架材料 目前脊髓损伤新型神经细胞支架材料较广泛，其中有：(1)天然材料：如纤维蛋白、葡聚糖、透明质酸、壳聚糖等。(2)合成材料：可降解的合成生物材料或由两种或两种以上的不同材料优化组合而成的复合材料，可降解的合成生物材料如聚吡咯等。复合材料如胶原质粘多糖(collagen–glycosaminoglycan，CG)、聚乳酸聚羟基乙酸共聚体—胶原复合物等。

　　1.2 基本要求 脊髓损伤新型神经细胞支架材料主要作用有三点：一是提供组织再生的支架或三维结构，二是调节细胞生理功能，三是免疫保护。除了符合一般生物医用材料的要求外，理想的脊髓损伤新型神经细胞支架材料还需满足如下要求：(1)良好的生物相容性：不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能。(2)良好的生物降解性：基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。(3)具有三维多孔结构：基质材料可加工成三维立体结构，孔隙率最好达9O% 以上，并具有较高的面积体比。这种结构可提供更大的表面积和空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和O2进入、代谢产物排出，也有利于神经长入。(4)可塑性和一定的机械强度：便于加工，而且移植到体内后能保持原有的形状。(5)良好的材料-细胞界面：材料应能提供良好的材料细胞作用界面，利于细胞粘附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持细胞表型表达。

　　2 脊髓损伤新型神经细胞支架材料

　　2.1 纤维蛋白(Fibronectin) 纤维蛋白[1]是一种高分子量的糖蛋白，可以从牛或人血浆中获得。纤维蛋白能约束胶原质，纤维和肝磷脂，能快速形成纤维蛋白垫,垫上的孔朝向相同的方向而有利于诱导神经元的再生，且它能提供细胞吸附位点和吸收生长因子，并像水池一样蓄积，加速神经组织的损伤修复。Alexander H[2]等用纤维蛋白粘合剂和马胶原作研究时，发现在脊髓部分横断时，纤维蛋白粘合剂和马胶原能提供去氧肾上腺素来增强轴突的再生，而不诱发不良反应，然而有去氧肾上腺素成功进入的再生轴突不能伸长到脊髓断端。通过这个实验他们发现脊髓更好的功能恢复有赖于纤维蛋白粘合剂和马胶原的治疗，因此他们认为在脊髓损伤的实验研究中纤维蛋白粘合剂和马胶原可以作为一种很好的支架材料。由于聚合作用无毒性，细胞可被埋入纤维蛋白凝胶剂，这对纤维蛋白能够在细胞移植中作为支架材料具有积极作用。然而鱼蛋白更适合二乙基溴乙酰胺生长，因为鱼类经历了惊人的中枢神经系统再生过程，在这个过程中，纤维蛋白原表现出了很强的促进作用。Yo-El Ju[3]等研究了人、牛等哺乳动物和鲑鱼的中枢神经系统的生长，发现鲑鱼纤维蛋白凝胶剂最有助于轴突的生长且最能抵抗细胞蛋白酶的降解作用。阴离子交换层析显示了鲑鱼和哺乳动物纤维蛋白素原洗脱图的不同，这些数据表明鲑鱼纤维蛋白比哺乳动物纤维蛋白更能促进神经元的生长，证明在中枢神经系统损伤后，鲑鱼纤维蛋白也许能作为有益的支架来促进神经元中二乙基溴乙酰胺的生长，而二乙基溴乙酰胺能促进神经元的生长。

　　2.2 葡聚糖(Dextran) 葡聚糖[4]是一种由葡萄糖亚基构成并有抗凝血作用的复合多糖体。 由葡聚糖制成的支架对蛋白质和细胞粘附有抵抗力。为了发挥其能够涂覆在神经埋植剂上的作用，医学工作者对其进行了研究，发现葡聚糖能够被化学改性以增强细胞粘附位点选择性和生长因子的吸附。新近的制造技术使可以被细胞浸润的大孔葡聚糖支架的制造成为可能。

　　2.3 透明质烷(Hyaluronan) 透明质烷[4]也叫做透明质酸,是一种通过ECM在脑中发现的线性粘多糖,它使中枢神经系统组织工程学的研究更有意义。尽管它对细胞无粘连，但其具有细胞吸附位点且无免疫原性。它能够帮助促进创伤愈合，这在组织修复中是非常重要的。使用透明质烷的一个缺点是其具有水溶性，使没有加入其它元件的可注射模型很难形成，因而不能将其连接到一个稳定的支架上。

　　2.4 壳聚糖(chitosan) 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化产物，其结构与细胞外基质成分糖胺聚糖(GAGs)相似，具有良好的生物相容性和要调节的生物降解性能，可通过各种途径如相分离、纤维连接、溶液流延等方法制成不同微观形貌与宏面性状，具有一定力学强度以适应不同部位神经修复操作要求的三维多孔支架[5～6]。为了更好地诱导脊髓损伤后神经轴突的恢复 ,Henrich Cheng[7]等设计了由一个多孔渗水壳聚糖支架组成的其内表面经氧等离子体处理混合有层粘连蛋白(laminin ，LN))的神经管。将其移植入SD大鼠骨髓T8缺损区域，一或两个月后，进行行为分析，免疫组化观察免疫印迹。碱解壳聚糖的脱乙酰作用能成功地被调节，而控制好了脱乙酰的程度就能定性地研究壳聚糖支架的性质。有研究表明壳聚糖有高的脱乙酰作用时其降解率低、机械性能高、细胞兼容性和细胞粘附性好，同时神经细胞的生长与壳聚糖中的胺有很大关系。实验最终将脱乙酰作用调节到了96.4±0.72% 。通过实验，研究人员断定LN-NC 能够导致轴突在管内的再生并且加强其再生能力，如在LN-NC里放入大量的GAP-43 ，则能更好地促进神经再生。实验结果还表明延长氧等离子处理时间将会破坏多孔渗水壳聚糖支架的微观结构。动物实验的最终结果表明通过神经管的移植动物行为有改进;ED-1,Tubulin beta III,and GAP-43的免疫染色阳性表明神经管能够诱导损伤轴突伸过损伤区与其另一端连接; COX-2和Caspase-3的免疫染色阴性表明神经管不一定会引起炎症反应和细胞凋亡。

　　2.5 聚毗咯(polypyrrole) 为了提高神经细胞与导管的亲和力，R.T.Richardson等[8]发现了有良好生物降解性和理化特性的聚毗咯(PPy)，并将它作为神经组织工程细胞外基质材料。他们认为，单独的聚合体移植也有其自身的优点：稳定性和生物降解性好。为了证明聚吡咯的生物降解性，他们分离了最初的小鼠大脑皮层细胞，培养在混有聚苯乙烯，磺酸盐(PSS)或十二烷基苯磺酸钠(NaDBS)的聚吡咯模型中。体内和体外实验观察发现神经纤维网络增长在所有聚吡咯的表面，神经元和胶质细胞都有很好的生物降解性。他们的观点支持了未来设计神经修复学的研究将可能在使用有特殊理化性质的聚吡咯聚合物上来。同时，也要以联系神经系统组织为基础。现在有学者做了一系列的工作来改善PPy作为支架在脊髓损伤修复神经组织工程中的作用，且已经做了大量的工作来阐述聚毗咯怎样以不同的方式来提高它作为支架在脊髓损伤修复神经组织工程中的作用。

　　2.6 胶原质粘多糖(collagen–glycosaminoglycan，CG) Brendan A[9]等采用冰冻干燥法将胶原质粘多糖制成了CG支架，该支架有均匀一致的由等轴晶粒组成的毛孔微观结构。实验测示了低密度的压力--张力、网化微孔泡沫的独特线性弹力、水合作用、毛孔尺寸、交联密度和相对密度等一系列变量的单独作用，发现该种支架的每一个毛孔都有等方性的机械性能且与毛孔大小无关。为了进一步明确微孔立体理论在CG支架系统其材料和机械性能上的作用，对其作了进一步的研究。这项研究最重要的方面是制造一系列的实验模型并从其结构和机械性能上对其进行描述。在这些支架中离散增长的单个细胞的细胞外环境的局部微结构和机械性能可以被清楚地观察和改良。

　　2.7 聚乳酸聚羟基乙酸共聚体—胶原复合物 (PLGA–gelatin complex) Xiao-kunLi[10]等通过研究发现细胞在胶原上的粘附性比在聚乳酸聚羟基乙酸共聚体(polylactic acid-co-glycolic acid，PLGA)上好，但是胶原的机械性能不如PLGA好，因此他们通过用不同比率的PLGA和胶原制成复合物支架在体外来研究其机械性能、生物降解性能、3D显微结构和雪旺细胞的粘附能力来证明复合材料制作神经支架的潜能。首先从制得的明胶微球中选出直径小于10μm的明胶微球，将PLGA和明胶微球按不同比率分别加入二氯甲烷 (DCM)，当PLGA完全溶入DCM时用 超声波使明胶微球均匀地散入PLGA-DCM 溶液(明胶微粒未溶入DCM)，这样就制得了悬浮液，之后将悬浮液转移到一个特殊的装置中使其成形，并置于自然条件下，这样就制成了一个中空支架，最后将支架在真空中烘干48小时后移去可溶DCM，这样就制得了他们想要的支架。损伤的修复受多个因素的影响，像支架的正确置入，微环境的诱导再生作用，药物和神经生长因子等，总之测试结果表明该支架具有良好的生物适应性，持续释放性和适当的机械性能，综合考虑有关神经支架的各种因素，用PLGA作为主材料用明胶作调试试剂制成的支架具有很大的前景。

　　3 存在的问题

　　目前应用于脊髓的组织工程支架多采用可降解性天然或合成高分子生物材料。该类材料最大优点是生物相容性好，降解产物易于被吸收而不产生炎症反应，但存在力学性能差，尤其是力学强度与降解性能间存在反对应关系，即高强度源于高分子量，导致降解速度慢，难于满足组织构建的速度要求，也使构建多孔三维支架存在困难。可降解性合成高分子材料[11]是目前组织工程用生物材料的主要研究对象。这类材料降解速度和强度可调，容易塑型和构建高孔隙度三维支架，但这类材料本质缺陷在于其降解产物容易产生炎症反应，降解单体集中释放，会使培养环境酸度过高。另外，该类材料对细胞亲和力弱，往往需要物理方法或加入某些因子才能黏附细胞。还有复合材料制成的支架在兼顾其它优良功能而改变复合物比例时，其韧性和硬性等机械性能和同质性可能变低，不利于支架对负荷的承受。

　　4 展望

　　要制成具备立体定向排列孔径结构的应用于脊髓组织的组织工程支架，需要极高的制备工艺，但目前制备工艺技术已日趋成熟，在机械制造领域快速成型技术发展迅速，其应用领域也逐渐扩展到组织工程三维多孔支架的制备上来。以前的生物材料在组织工程应用过程中，其表面缺乏细胞可进行识别的位点，但近年来利用工程学方法将具有特定信号识别功能的生物分子与现有材料结合成新一代有特定修复功能的材料，是当前生物领域材料的前沿课题。

　　【参考文献】

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