消化酶在口服Ⅱ型胶原蛋白治疗类风湿性关节炎中的作用

　　作者：姜旭淦,陈盛霞,吴亮,许化溪　　作者单位：江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏 镇江

　　【摘要】目的：观察消化酶在体内和体外对天然Ⅱ型胶原蛋白(native type Ⅱ collagen，N-C Ⅱ)和变性Ⅱ型胶原蛋白(denatured type Ⅱcollagen，D-C Ⅱ)的酶解作用，探讨口服Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen，CⅡ)治疗类风湿性关节炎的机制。方法：在体外将胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶分别作用于N-C Ⅱ和D-C Ⅱ，采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法分析酶解产物。将N-C Ⅱ和D-C Ⅱ注入鼠胃内和十二指肠，把不同时间收集的胃和肠内容物进行SDS-PAGE电泳分析。结果： N-C Ⅱ分子和亚基都能与兔抗鸡CⅡ抗体反应;D-C Ⅱ可被分解成十多条免疫印迹反应呈阳性的蛋白片段。CⅡ在胃、肠道能处于溶解状态。在体外，N-C Ⅱ在胃蛋白酶和α-糜蛋白酶作用下电泳和免疫印迹图谱无变化，而被胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹为阳性的条带;D-C Ⅱ易被上述消化酶分解。N-C Ⅱ不被胃内环境水解，可被肠道消化酶缓慢降解;D-C Ⅱ可被胃、肠道消化酶迅速分解。结论： N-C Ⅱ可被胰蛋白酶水解产生多条活性片段，但对胃内环境、胃蛋白酶和α-糜蛋白酶具有抵抗力;D-C Ⅱ易被胃、肠道消化酶水解。结果提示口服CⅡ诱导免疫耐受、治疗类风湿性关节炎可能与CⅡ特性和胰蛋白酶对它的作用有关。

　　【关键词】 Ⅱ型胶原蛋白; 胃蛋白酶; 胰蛋白酶; α-糜蛋白酶; 类风湿性关节炎

　　[Abstract]　Objective： To observe the enzymolysis of digestive enzymes on the native type Ⅱ collagen (N-C Ⅱ) and the denatured type Ⅱcollagen (D-C Ⅱ) in vitro and in vivo in order to study the mechanism of treating rheumatoid arthritis (RA) by oral administration of type Ⅱ collagen (CⅡ). Methods： N-C Ⅱ and D-C Ⅱ were respectively treated with pepsin， trypsin and α-chymotrypsin in vitro and the products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. N-C Ⅱ and D-C Ⅱ were infused to the murine stomach and duodenum. The gastric contents and intestinal contents were collected at different time and analyzed by SDS-PAGE. Results： N-C Ⅱ and its subunits could all react with the rabbit anti-C Ⅱ antibody. D-C Ⅱwas pyrolyzed to more than 10 fragments showed positive in immunoblotting. CⅡcould be with the lyso-state in the gastrointestinal tract. After the pepsin and α-chymotrypsin treatments， the N-C Ⅱ SDS-PAGE and immunoblotting graphs had no obvious change， but for D-C Ⅱ the positive bands in immunoblotting vanished. After the trypsin treatment,10 positive bands in immunoblotting could be seen for N-C Ⅱ and no positive bands for D-C Ⅱ. N-C Ⅱcould not be hydrolyzed in gastric environment and could be slowly degraded in intestinal tract. D-C Ⅱcould be easily hydrolyzed by the digestive enzymes in the gastrointestinal tract. Conclusion： N-C Ⅱcan be produced active fragments by the trypsin treatment and had resistance to gastric environment， pepsin and α-chymotrypsin. D-C Ⅱcan be easily hydrolyzed by the digestive enzymes in the gastrointestinal tract. The results suggest that the inducing immunotolerance to treat RA by oral administration of CⅡ is possibly concerned with the CⅡ characteristics and trypsin enzymolysis.

　　[Key words]　type Ⅱcollagen; pepsin; trypsin; α-chymotrypsin; rheumatoid arthritis

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性、进行性、对称性、侵蚀性的自身免疫性疾病，对人体健康危害大。研究表明，RA的发病与Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen，CⅡ)引起的自身免疫反应有关[1-2]，在10%～30%的RA患者血清和关节滑液中可检测到抗天然和变性CⅡ抗体，在滑膜组织中存在CⅡ-C Ⅱ抗体免疫复合物，用CⅡ免疫动物可产生胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)[3-5]。近年来利用口服CⅡ或CⅡ变构肽诱导免疫耐受治疗RA成为研究的热点。部分学者研究结果提示，口服CⅡ能明显降低抗CⅡ抗体水平，降低RA的发生率和病情严重程度[6-7]，抑制特异性细胞和体液免疫应答[8]，但口服CⅡ的剂量、剂型、机体胃肠道黏膜免疫状态等均对结果产生影响[9]，特别在CⅡ自身抗体产生和诱导免疫耐受机制方面进展缓慢，极大地限制了CⅡ的临床应用。要揭示CⅡ治疗RA的作用机制，首先要了解口服CⅡ后在胃肠道的存在状态以及消化酶对它的作用。但目前尚无相关报道。本文旨在研究胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和胃肠道对天然Ⅱ型胶原蛋白(native type Ⅱ collagen，N-C Ⅱ)和变性Ⅱ型胶原蛋白(denatured type Ⅱ collagen，D-C Ⅱ)的分解作用，采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法分析酶解产物，为阐明通过口服CⅡ诱导免疫耐受治疗类风湿性关节炎提供依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂

　　胃蛋白酶(Amersco分装)购自武汉博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶(T0303)和α-糜蛋白酶(C4129)购自Sigma-Aldrich公司;HRP羊抗兔IgG(SA0040)购自上海普飞生物技术有限公司;29 000～205 000和25 000～200 000蛋白质相对分子质量标志物分别购自上海华舜生物工程有限公司和Fermentas Life Sciences公司。

　　1.2　N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的制备

　　以鸡胸箭突软骨为原料，采用限制性胃蛋白酶消化法提取与纯化CⅡ[10]，该蛋白为N-C Ⅱ。将N-C Ⅱ溶解于0.05 mol/L 醋酸，100 ℃加热10 min，所得产物为D-C Ⅱ。

　　1.3　溶液酸碱度与Ⅱ型胶原蛋白溶解性的测定

　　采用透射比浊法，参照文献[11]方法进行。

　　1.4　兔抗鸡Ⅱ型胶原蛋白抗血清的制备

　　将2 mg/ml CⅡ与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，于新西兰白兔的背部皮下进行多点注射，第20天追加抗原刺激。第40天耳静脉采血，分离血清，以ELISA法检测抗CⅡ抗体效价[5]。

　　1.5　在体外消化酶对Ⅱ型胶原蛋白的作用条件

　　根据胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶的特性，选择不同pH溶液将其溶解，配成6 g/L的酶液。胃蛋白酶用0.1 mol/L醋酸配制，胰蛋白酶和α-糜蛋白酶用0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)缓冲液配制。用1 mol/L NaOH 将3 g/L N-C Ⅱ和D-C Ⅱ溶液调节到酶液pH，分别加入等量酶液，混匀，37 ℃反应20 min，立即加入等体积的电泳样品缓冲液，100 ℃ 5 min，取出冷却后进行SDS-PAGE电泳。

　　1.6　胃肠道消化酶对N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的作用

　　1.6.1　小鼠胃肠道消化酶对N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的作用

　　昆明种小鼠(18～20 g)6只，实验前禁食8 h，分为3组，采用灌胃方式分别给予0.5 ml 0.1 mol/L醋酸、0.5 ml 4 g/L N-C Ⅱ和0.5 ml 4 g/L D-C Ⅱ。30 min 后处死，取出胃和小肠。用1 ml Tris-HCl(pH8.0)缓冲液冲洗胃内容物，1 ml 0.1 mol/L醋酸冲洗小肠内容物，收集冲洗液。将收集液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳。

　　1.6.2　大鼠胃肠道消化酶对N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的作用

　　SD大鼠(180～200 g)9只，实验前禁食8 h，分为3组。用戊巴比妥腹腔注射麻醉，剖腹，在胃与十二指肠连接处和小肠下段30 cm处打结，采用灌胃和从十二指肠注射法将0.1 mol/L醋酸、4 g/L N-C Ⅱ或D-C Ⅱ投放至胃和小肠，剂量为1 ml。投至十二指肠的N-C Ⅱ或D-C Ⅱ用pH8.0 Tris-HCl缓冲液配置。在30,60,90 min将其处死，取出胃和小肠。用2 ml pH8.0 Tris-HCl缓冲液冲洗胃内容物，2 ml 0.1 mol/L醋酸冲洗小肠内容物，收集冲洗液。将收集液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳。

　　1.6.3　SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析

　　参照文献[12]方法进行。SDS-PAGE电泳时，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为10%。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R250染色。电转印在4 ℃下进行，用丽春红染色法观察转印效果。免疫印迹主要步骤：将新鲜羊血清60 ℃ 20 min灭活，加入适量Tris(终浓度0.05 mol/L)和NaCl(终浓度0.15 mol/L)，用2 mol/L HCl调pH至8.0备用。转印膜用10%羊血清37 ℃封闭，加入用含10%羊血清的缓冲液作1 ∶ 1 000稀释的兔抗鸡N-C Ⅱ血清，孵育2 h;再加入HRP羊抗兔IgG(工作浓度为1 ∶2 000)，孵育1 h;用DAB-H2O2底物系统显色。

　　2　结　果

　　2.1　CⅡ提取与纯度鉴定

　　采用限制性胃蛋白酶消化法从鸡胸箭突软骨中获得了鸡D-CⅡ，其SDS-PAGE电泳结果。表明，本室提取的鸡D-CⅡ与Sigma公司参照品一致;电泳时可出现α、β、γ 3条区带，其中β和γ组分分别是α组分的二聚体和三聚体;α单体的相对分子质量为125 000。由于γ组分是完整的N-C Ⅱ，相对分子质量较大，经过样品缓冲液处理后多转变为α单体和少量β二聚体，故其含量很低，只在分离胶的起始端出现一条弱带，加样量少时则不出现。M：蛋白质相对分子质量标志物;1：Sigma公司 CⅡ;2：自提CⅡ　Ⅱ型胶原蛋白SDS-PAGE电泳

　　2.2　N-C Ⅱ和D-C Ⅱ免疫印迹分析

　　为N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的电泳和免疫印迹图谱。M：蛋白质相对分子质量标志物; 1,2：SDS-PAGE图谱;3,4：免疫印迹图谱;1,3：N-C Ⅱ;2,4：D-C Ⅱ　N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的电泳和免疫印迹图谱N-C Ⅱ经SDS-PAGE电泳后出现α、β组分，免疫印迹均呈阳性。D-C Ⅱ被分解成多条蛋白片段，β组分消失，免疫印迹反应阳性带的相对分子质量为125 000(α组分)和108 000,102 000,99 000，84 000，82 000,68 000,54 000,48 000,36 000，33 000，25 000等CⅡ片段。

　　2.3　溶液pH值与CⅡ溶解性

　　显示0.6 g/L N-C Ⅱ 溶液在不同pH条件下、波长为500 nm时所测得的光密度。在pH 3.5～8.0范围内，CⅡ溶液的浊度变化很大。当pH<4.5或pH>7.5时，N-C Ⅱ处于溶解状态，溶液透明，光密度接近于零;pH值在4.5～7.5范围内溶液出现浊度。溶液pH值对D-C Ⅱ溶解状态影响不大。　N-C Ⅱ溶液的pH值与光密度之间的关系

　　2.4　在体外消化酶对Ⅱ型胶原蛋白的作用

　　2.4.1　胃蛋白酶与N-C Ⅱ和D-C Ⅱ　图4显示N-C Ⅱ和D-C Ⅱ

　　经胃蛋白酶作用后SDS-PAGE电泳和免疫印迹图谱。胃蛋白酶在SDS-PAGE电泳图谱上可出现两条带，相对分子质量为42 000和40 000，免疫印迹呈阴性;N-C Ⅱ 经胃蛋白酶作用后，SDS-PAGE电泳和免疫印迹图谱无明显变化;D-C Ⅱ 经胃蛋白酶作用后，胶原蛋白片段消失，无免疫印迹阳性条带。M：蛋白质相对分子质量标志物;1：胃蛋白酶;2,4：N-CⅡ+胃蛋白酶; 3,5：D-C Ⅱ+胃蛋白酶　N-C Ⅱ和D-C Ⅱ经胃蛋白酶作用后的SDS-PAGE电泳和免疫印迹图谱

　　2.4.2　胰蛋白酶与N-C Ⅱ和D-C Ⅱ

　　胰蛋白酶条带出现在电泳前沿。N-C Ⅱ经胰蛋白酶作用后出现多条免疫印迹为阳性的蛋白条带，相对分子质量分别为125 000,117 000,105 000，87 000，80 000,69 000,47 000,39 000,33 000和24 000。D-C Ⅱ经胰蛋白酶作用后未见免疫印迹阳性蛋白条带。　M：蛋白质相对分子质量标志物;1：胰蛋白酶; 2,4：N-C Ⅱ+胰蛋白酶;3,5：D-C Ⅱ+胰蛋白酶　N-C Ⅱ和D-C Ⅱ经胰蛋白酶作用后的SDS-PAGE电泳和免疫印迹图谱

　　2.4.3　α-糜蛋白酶与N-C Ⅱ和D-C Ⅱ

　　实验结果与胃蛋白酶作用相同，α-糜蛋白酶出现在电泳前沿，相对分子质量约为28 000。N-C Ⅱ经α-糜蛋白酶作用前后，SDS-PAGE电泳和免疫印迹图谱无明显变化，而D-C Ⅱ可被α-糜蛋白酶水解。

　　2.5　在体内胃、肠道消化酶对C Ⅱ的作用

　　2.5.1　小鼠胃、小肠收集液的分析

　　小鼠灌胃N-C Ⅱ和D-C Ⅱ 30 min后处死，收集胃、小肠冲洗液，结果见图6。灌胃30 min后胃液中仍含有大量N-C Ⅱ，部分进入肠道，在肠液电泳图谱相应位置出现明显区带;D-C Ⅱ在胃液中只含少量，肠液中未见胶原蛋白相关条带。M：蛋白质相对分子质量标志物;1,4,7：N-C Ⅱ;2,5,8：D-C Ⅱ;3～5：胃收集液;6～8：小肠收集液;3,6：醋酸　N -C Ⅱ和D-C Ⅱ灌胃后小鼠胃、小肠收集液的SDS-PAGE电泳

　　2.5.2　大鼠胃、小肠收集液的分析

　　以灌胃或用注射的方法将醋酸、N-C Ⅱ和D-C Ⅱ投放至麻醉大鼠胃和小肠后，在30,60,90 min处死并收集胃和小肠内容物。在胃收集液中，N-C Ⅱ在观察时间内未发生变化，D-C Ⅱ条带则随时间的延长逐渐变淡。在小肠收集液中，N-C Ⅱ在观察时间内可见明显条带;D-C Ⅱ在30 min可见少量，60,90 min则未检测出。M：蛋白质相对分子质量标志物; 1：CⅡ;2：D-C Ⅱ;3：醋酸：4～6：给予N-C Ⅱ 30 ,60,90 min的收集液;7～9：给予D-C Ⅱ30,60，90 min的收集液　给予N-CⅡ和D-C Ⅱ后大鼠胃、肠收集液的SDS-PAGE电泳

　　3　讨　论

　　胶原蛋白是许多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，由于具有低毒性、低抗原性、低免疫性、引导细胞再生和与人体相容性较好等特点，已被广泛应用于生物医学材料和临床医疗[13]。CⅡ是软骨基质中含量最高的主要有机成分，目前主要从鸡、猪、牛、兔等动物的透明软骨中提取[14]。由于CⅡ溶解性很差，并且与蛋白多糖形成紧密的结合，因而难以用单纯的化学方法提取，目前采用胃蛋白酶和链霉蛋白酶(pronase)限制性酶降解法，去除CⅡ部分伸直端尾肽，使螺旋结构不受影响，保持CⅡ分子完整性和抗原性[14]。我们以鸡胸箭突软骨为原料，制备出高纯度的可溶性Ⅱ型胶原蛋白[10]，SDS-PAGE电泳图谱显示1条含量高的α带和2条含量较少的β二聚体、γ三聚体条带，都能与兔抗鸡CⅡ抗体反应，被加热后可以分解成十多条免疫印迹反应呈阳性蛋白片段，说明CⅡ及其片段都具有与抗CⅡ抗体反应的能力。通过对N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的酶解分析，可以看出保持完整螺旋结构的CⅡ分子不被胃蛋白酶水解，变性后的D-C Ⅱ则被胃蛋白酶快速水解。

　　CⅡ是目前公认的关节软骨特异性抗原，在10%～30%的类风湿关节炎患者血清中可检测到CⅡ自身抗体，用CⅡ免疫动物可以诱导类风湿性关节炎动物模型并产生较强的体液免疫和细胞免疫应答[2-5,15]。口服CⅡ诱导免疫耐受、治疗和预防类风湿性关节炎正在引起人们的关注，通过关节病变评分、血清CⅡ抗体水平等对疗效进行评价。目前CⅡ诱导免疫耐受、自身抗体产生和变化的机制还不十分清楚。部分学者曾提出分子模拟机制学说，认为自身抗体的形成可能是饮食中的胶原片段刺激胃肠道黏膜免疫系统和全身免疫器官所致[16]。本文考察了胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和胃肠道对N-C Ⅱ和D-C Ⅱ的分解作用，实验结果表明，CⅡ在胃、肠道环境中能处于溶解状态;N-C Ⅱ不被胃蛋白酶、α-糜蛋白酶和胃内环境水解，但胰蛋白酶可对其作用并产生多条免疫印迹为阳性的蛋白条带;D-C Ⅱ 对胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和胃肠道环境无抵抗能力，易被水解吸收。上述结果提示饮食中的胶原如加工不当未发生变性，可在肠道停留较长时间并产生活性片段。这些未变性C Ⅱ 及其片段，一方面可能刺激胃肠道黏膜免疫系统，诱导免疫耐受和C Ⅱ 抗体的形成;另一方面可在肠道被吸收，进入体循环，刺激其他免疫器官或与体循环中抗体结合，产生免疫应答，影响血清C Ⅱ 抗体水平和关节病变程度。

　　早在1998年，日本学者Matsumoto等[17]在DBA/1 CIA模型小鼠中进行了鼻内给予D-C Ⅱ及其片段与类风湿关节炎关系的研究，发现D-C Ⅱ及其片段能显著推迟CIA的发生，而N-C Ⅱ无作用;高欣等[18]采用CⅡ溴化氰裂解片段免疫印迹法检测到类风湿关节炎患者血清中存在针对裂解片段的抗体;Zhu等[8]亦报道经口给予CⅡ250-270多肽能抑制CIA模型小鼠的细胞和体液免疫应答。我们也发现经加热和胰蛋白酶作用后的酶解片段均可不同程度地表现出其与Ⅱ型胶原抗体的免疫反应性，提示Ⅱ型胶原分子广泛存在着多个重复的抗原决定簇。通过对CⅡ片段的研究，可以进一步提高CⅡ的临床应用价值。加热分解法、溴化氰裂解法和合成法都可生成CⅡ片段，但操作过程复杂，条件难以控制。CⅡ经胰蛋白酶作用后能产生较稳定的具有免疫反应性片段，操作简单，可大量制备。然而这些片段有无免疫原性，能否有效地诱导机体产生抗体或介导特异性免疫耐受，有待于进一步证实。

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