骨肉瘤组织中骨桥蛋白、COX-2和VEGF表达

　　作者：廖有乔,李锋,熊敏,刘家国,张劲松,徐圣康

　　[摘要]　目的:探讨骨肉瘤组织中骨桥蛋白(OPN)、环氧化酶-2(COX-2)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的临床意义。方法:应用免疫组化方法检测38例骨肉瘤组织中OPN、COX-2和VEGF蛋白表达情况。结果:OPN、COX-2和VEGF蛋白总阳性率分别为60.53%，63.16%, 68.42%, 在不同恶性级别的骨肉瘤中均具有差异性(P<0.05)，而且与肿瘤的恶性程度相关;COX-2，OPN与VEGF表达正相关。结论:OPN，COX-2和VEGF在肿瘤的进展过程中起促进作用,OPN和COX-2是VEGF表达调控因子。OPN可能是肿瘤形成过程中的早期分子事件,可作为监测肿瘤恶性进展的一个生物学标志。

　　[关键词]　免疫组化;血管生成;骨肉瘤; COX-2;VEGF;OPN

　　Expression of Osteopontin,COX-2 and VEGF in Osteosarcoma

　　LIAO You-qiao，LI Feng, XIONG Min，LIU Jia-guo，ZHANG Jin-song，XU Sheng-kang.

　　(Department of Orthopaedic,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan，Hubei 442000;Department of Orthopaedic,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan，Hubei 443007;Department of Orthopaedic,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective　To observe the expression of OPN,COX-2 and VEGF in osteosarcoma.Methods The expression of Osteopontin,COX-2 and VEGF in 38 cases with osteosarcoma was examined with immunohistochemistry.Results　The total positive rate of OPN,COX-2 and VEGF was 60.53%,63.16%, 68.42%,respectively.There was significant difference among different malignant osteosarcoma (P<0.05),and the expression was correlated with the malignant degree.VEGF expression was positively correlated with the expression of OPN and COX-2. Conclusion OPN,COX-2 and VEGF play a role in the pathogenesis of osteosarcoma,OPN and COX-2 are regulatory factors of VEGF expression.OPN expression may be an early molecular event in the process of tumorigenesis and could be used as a biological marker to monitor the malignant process of osteosarcoma.

　　Key words:Immunohistochemistry;Angiogenesis;Osteosarcoma;COX-2;VEGF;OPN

　　骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，恶性度极高，预后差，目前其发生发展的过程尚不清楚，临床上也缺乏特异性的病理诊断指标。有研究认为骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、环氧化酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与一些恶性肿瘤的发生有关，并可作为肿瘤诊断及判断预后的辅助指标[1-5]，但其与骨肉瘤的关系尚不十分清楚。本研究采用免疫组织化学方法检测骨肉瘤组织中OPN、COX-2和VEGF的表达，以探讨此三者与骨肉瘤发生的关系及其临床意义。

　　1　　材料与方法

　　1.1　　标本收集38例由同济医学院附属同济医院提供的1998 年-2004年行手术切除且保存完好的骨肉瘤组织的石蜡标本。患者术前均未行放、化疗，其中男 23例,女15例,年龄 7～65 岁， 平均年龄21岁。所有标本均经常规切片、HE染色, 并经3位病理科医师确认为骨肉瘤：低恶性度骨肉瘤14例, 高恶性度骨肉瘤24例。

　　1.2　　免疫组织化学方法采用SP免疫组织化学染色方法,OPN、COX-2和VEGF单克隆抗体均购于北京中山生物技术公司，工作浓度为1∶100。以 PBS代替一抗，作为空白对照, 以正常骨组织作为阴性对照, 按试剂说明书选择阳性对照。

　　1.3　　判断标准镜下根据阳性细胞数及阳性细胞着色强弱，进行免疫组化染色评分：无阳性细胞计0,阳性细胞占1%～10%计1分,11%～50%计2分,51%～80%计3分,81%～100%计4分;阳性细胞染色强弱:阴性计0,弱阳性计1分，中度阳性计2分，强阳性计3分。 两项的乘积即为该例病变的免疫组化评分。综合免疫组化评分：0定为-，1～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++。

　　1.4　　统计学方法结果采用 SPSS10.0统计软件包进行卡方检验，spearman等级相关分析。检测水准为α=0.05，P<0.05为差异有显著性

　　2　　结果

　　2.1　　在肿瘤中的表达与分布情况OPN在肿瘤浸润边缘表达明显增多，主要在肿瘤细胞胞质; COX-2主要在胞质和核膜;而VEGF则在胞浆中表达较多(图1~3)，三者的阳性表达率分别为60.53%，63.16%, 68.42%。

　　2.2　　OPN、COX-2及VEGF表达及与临床病理因素的相互关系表1可见，OPN、COX-2及VEGF表达水平的多少与患者的年龄、性别及肿瘤的组织类型无关，而与骨肉瘤组织的分化程度有关，在高恶性度和低恶性度肿瘤中其表达差异具有显著性,P值分别为0.016，0.023，0.037;OPN阳性组,VEGF表达阳性高达86.36%，OPN阴性组,VEGF表达阴性率亦可达87.50%，显示高度显著性差异(见表2，χ2=20.44,P<0.001);且COX-2、OPN与VEGF表达均呈正相关(rs=0.098,P<0.01;rs=0.45,P<0.01)。

　　表1　　OPN、COX-2、VEGF阳性表达和临床病理因素之间的关系(略)

　　表2　　骨肉瘤组织中OPN与VEGF表达的关系(略)

　　3　　讨论

　　血管生成和血管对缺氧的适应性是肿瘤发展过程中的关键步骤。新生血管的形成对实体瘤的生长起决定作用。缺氧是肿瘤细胞生长、凋亡、转移等的主要驱动力，OPN作为肿瘤微环境中的调节因子，在促进肿瘤血管生成和肿瘤的侵袭性方面起重要作用[6],OPN在一系列人类肿瘤中表达上调,并且在一些癌前病变组织中也检测到OPN的存在,提示它可能是肿瘤进展过程中早期事件，对预测肿瘤的侵袭性具有潜在价值。本实验结果表明,在低度和高度恶性级别中 OPN阳性表达差异具有显著性。 随着恶性级别的增加,OPN的表达增高,这与大多数实验的结果是相符的[1,7]，同时OPN表达具有异质性，在肿瘤浸润边缘区域表达增高, 也与国外Ariztia[8]的研究结果相符。提示OPN可能对骨肉瘤组织的侵袭性生长起作用，可能是骨肉瘤组织形成过程中早期分子事件[9]。

　　COX-2是重要的限速酶, 呈诱生性表达，大多数正常组织中表达极少，各种刺激如细胞因子、生长因子、癌基因及促肿瘤剂诱导后可迅速合成,具促细胞增生、抑制凋亡以及刺激新生血管生成等多种功能。有实验发现COX-2催化前列腺素产物以自分泌和旁分泌的形式发挥作用, 其产物PGE2可通过活化磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白激酶B(AKT/PKB)途径, 经EP4受体促进细胞生长和运动[2]。它可通过Bcl-2介导通路、一氧化氮(NO)通路、神经酰胺通路及增强AKT激酶介导通路或NF-κB通路抑制细胞凋亡[10-11]。本实验证实高恶性度骨肉瘤组织中COX-2的表达较低恶性度表达增强，与国外Joki[12]等的研究结果相符。VEGF可以增加微血管通透性,改变内皮细胞的活化方式,在原位诱导血管生成,随着恶性级别的增加,VEGF的表达强度增强,在不同恶性级别的骨肉瘤组织中表达具有差异性，亦与大多数实验结果相符[11-12]。

　　本实验结果表明了OPN、COX-2和VEGF在骨肉瘤组织中的表达呈正相关,且在OPN阳性表达组与阴性组VEGF表达差异具有显著性。OPN在肿瘤缺氧环境和癌基因的激活以及抑癌基因的失活时激活并过量表达,它能与VEGF基因中的缺氧反应产物HER中的共有序列结合,在转录水平上增加VEGF的表达;在低氧环境中OPN还可以显著增加VEGF mRNA的稳定性,从而上调VEGF蛋白表达水平。 COX-2在肿瘤组织内部缺氧的刺激下能上调血管生成因子VEGF的表达[13-14],其产物如PGE2和PGI2可直接刺激内皮细胞的迁移和加速生长因子诱导的血管生成,它还可通过激活Bcl-2或Akt抑制内皮细胞凋亡[15]。由此可见，OPN、COX-2是通过协同作用于VEGF，以共同促进骨肉瘤的恶性进展。

　　(文中图1~3见封二)(略)

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　　(郧阳医学院附属太和医院骨科，湖北 十堰　　442000;华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北 武汉　　443007;郧阳医学院附属东风公司总医院骨科,湖北 十堰　　442000)