淫羊藿总黄酮对金属离子刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响

　　作者：戈兵,郭开今　陈宏亮 作者单位：1.泗洪县人民医院骨科, 江苏泗洪223900;2.徐州医学院附属医院骨科,江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 通过观察淫羊藿总黄酮(total flavones of Epimedium, TFE)对金属离子(Co2+)刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,探讨TFE抑制TNF-α分泌的机制以及防治关节假体的无菌性松动的可能性。方法 采集36例健康志愿者的外周血,分离单核细胞,分组培养。实验分成6组。A组:仅单核细胞; B组:单核细胞+金属离子;C组:单核细胞+金属离子+帕米膦酸钠10 mg/L; D组:单核细胞+金属离子+TFE 5 mg/L; E组:单核细胞+金属离子+TFE 10 mg/L;F组:单核细胞+金属离子+TFE 20 mg/L。单核细胞培养48 h后,ELISA法测定细胞上清液中TNF-α的含量。结果 B组TNF-α的含量明显高于A组(P<0.01); C、D、E、F组TNF-α的含量分别明显低于B组(P<0.01); D、E组之间及E、F组之间TNF-α的含量差异均有显著性(P<0.05)。结论 金属离子可刺激单核细胞使其分泌溶骨性因子TNF-α的量增加。TFE与帕米膦酸钠作用效果相似,可降低溶骨性细胞因子TNF-α的分泌,随着TFE浓度的增加,其降低TNF-α分泌量的作用加强，从而有望成为防治关节假体松动的药物之一。

　　【关键词】 淫羊藿总黄酮;二膦酸盐;金属离子;骨溶解;假体松动

　　Effect of total flavones of Epimedium on secreting TNF-α due to stimulation

　　of human monocytes by metal ion

　　GE Bing1， GUO Kaijin2， CHEN Hongliang2

　　(1. Department of Orthopedics, People′s Hospital of Sihong County, Sihong, Jiangsu 223900， China;

　　2. Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract:Objective By observing the effect of total flavones of Epimedium (TFE) on secreting TNF-α due to stimulation of human monocytes by metal ion cobalt(Co2+), to discuss the role of TFE in decreasing the secretion of TNF-α, providing a theoretical support for using the herbal medicine to prevent and treat aseptic loosening of joint prosthesis.Methods Blood samples obtained from 30 healthy human donors were processed to get the monocytes to perform the present experiment in 6 groups. group A: containing monocytes only; group B: monocytes + metal ion; group C: monocytes + metal ion + pamidronate 10 mg/L; group D: monocytes + metal ion + TFE 5 mg/L; group E: monocytes + metal ion + TFE 10 mg/L; and grou F: monocytes + metal ion + TFE 20 mg/L. The mixtures were cultured for 48 h to determine the concentration of TNF-α by ELISA.Results The level of TNF-α was much higher in group B than in group A, C, D, E and F (P<0.01). There was significant statistical difference between group D and group E (P<0.05) and between group E and group F (P<0.05).Conclusion Being stimulated by metal ion, monocytes can secrete TNF-α. The inhibitory effect of TFE is similar to that of pamidronate, and is proportional to the concentration of TFE. It seems that TFE can be a potential therapeutic agent for the prevention and treatment of aseptic loosening of joint prosthesis.

　　Key words： total flavones of Epimedium; bisphosphonate; metal ion; osteolysis; prosthesis failure

　　人工关节置换目前已广泛应用于临床。人工关节磨损颗粒能刺激巨噬细胞/单核细胞产生大量溶骨性因子，包括肿肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-6(IL-6)等,这些溶骨性因子能刺激破骨细胞产生骨溶解,最终导致人工关节无菌性松动[1-3]。文献报道淫羊藿总黄酮(total flavones of Epimedium， TFE)可以抑制TNF-α的基因表达,从而达到抗骨质疏松的作用[4]。本实验通过体外实验将单核细胞、金属离子、二膦酸盐类药物帕米膦酸钠、TFE共同培养,观察TFE对金属离子诱导的溶骨性因子TNF-α释放的影响。

　　1 资料和方法

　　1.1 样本采集 36例健康献血者。男18例,女18例,年龄39～68岁,平均52.8岁。每例采集外周血10 ml肝素抗凝。

　　1.2 试剂和器材 TFE(沈阳药科大学),帕米膦酸钠(南京正大天晴制药有限公司), CoCl2粉末(南康化学仪器公司),RPMI-1640培养基(丹麦GIBCO公司),6孔细胞培养板(Corning公司),胎牛血清(杭州四季青公司), TNF-α放射免疫试剂盒(北京东亚免疫技术研究所),二氧化碳培养箱(美国Forma Scientific公司)。

　　1.3 方法及分组 无菌采集外周血以Hank液稀释1倍,分层液梯度离心法分离出单核细胞。洗涤3次,加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液,细胞计数,调整细胞数至4×108/L,锥虫蓝排除法检测细胞活力均大于95%。6孔培养板中滴加细胞悬液,每孔加3 ml，置37℃、5% CO2恒温恒湿培养箱培养4 h,使细胞贴壁,洗去非贴壁细胞,留下单核细胞。每板第1孔内加入含10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液3 ml，其余5孔加入终末浓度为10 mg/L CoCl2溶液3 ml，并于第3孔加入帕米膦酸钠使其浓度为10 mg/L,于第4、5、6孔加入TFE使其浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L。即第1孔为仅有单核细胞的对照组(A组),第2孔为单核细胞+金属离子组(B组),第3孔为单核细胞+金属离子+帕米膦酸钠10 mg/L(C组),第4孔为单核细胞+金属离子+TFE 5 mg/L(D组)，第5孔为单核细胞+金属离子+TFE 10 mg/L(E组)，第6孔为单核细胞+金属离子+TFE 20 mg/L(F组)。各组同条件培养48 h,取上清液,测定上清液中的TNF-α含量。

　　1.4 统计学处理 数据以±s表示,采用SSPS 13. 0软件包行方差分析和q检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　6种不同处理组上清液中TNF-α含量的比较见表1。方差分析显示,6组细胞上清液中TNF-α含量差异有显著性(F=3495, P<0.01)。两两比较显示,B组TNF-α含量明显高于A组(P<0.01),表明金属离子可以刺激单核细胞使TNF-α的分泌量增加;C、D、E、F组TNF-α含量分别明显低于B组(P<0.01), D、E组TNF-α含量分别与C组之间的差异无显著性(P>0.05),表明帕米膦酸钠和TFE均能降低TNF-α的分泌量; D、E、F组两两之间TNF-α含量差异均有显著性(P<0.05),表明随着TFE浓度的增加,对TNF-α分泌量的抑制作用增强。表1 各组细胞上清液中TNF-α含量的比较

　　3 讨 论

　　迄今为止,不管假体设计得多么完美,所有类型人工关节的承重面都产生磨损颗粒[5]。磨损微粒激活巨噬细胞分泌大量溶骨性因子,溶骨性因子刺激破骨细胞产生骨溶解,最终导致人工关节的无菌性松动,TNF-α、IL-1和IL-6是参与其中的主要溶骨性因子。Nakashima等[6]在体外研究中发现,暴露于钛合金微粒下48 h的巨噬细胞,其TNF-α、IL-6的释放量分别增加了40倍和7倍。干预这些溶骨性因子以寻求防治关节松动的药物成为当前研究的热点。本实验通过人外周血与金属离子混合培养亦发现金属离子能够刺激单核细胞分泌大量的TNF-α,证明金属离子在关节松动中有重要的作用。

　　二膦酸盐类药物因其在防治骨质疏松和肿瘤性骨溶解方面的成功应用,而被用来治疗关节无菌性松动。近年来的研究表明,西药二膦酸盐类能够有效抑制磨损微粒介导的骨质吸收[7]。TFE是我国传统的补肾壮骨中药淫羊藿的主要成分之一。淫羊藿不但可诱导破骨细胞凋亡,抑制骨吸收,减少骨量丢失,同时可促进体外成骨细胞增殖及分化成熟[8]。近年来,国外学者先后从豆科植物中提取到了具有抗骨质疏松作用的黄酮类化合物或衍生物[9-10]。人工关节无菌性松动的溶骨机制与骨质疏松的骨量丢失有很大的相似性,TFE在治疗骨质疏松方面的作用已得到充分的肯定,而且其来源广泛,价格低廉,副作用少。本实验通过检测外周血TNF-α含量发现,当单加入金属离子时细胞上清液中TNF-α的含量较其他组为最高,这表明金属离子可以刺激TNF-α的分泌。而加入帕米膦酸钠或TFE后细胞上清液中TNF-α的含量明显下降,表明TFE与帕米膦酸钠作用效果相似,可以抑制细胞因子TNF-α的分泌,且随着TFE浓度的增加其抑制作用加强。说明TFE能够抑制这种刺激作用,抑制溶骨因子分泌,从而对人工关节远期松动具有一定的预防作用。

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