体外培养大鼠软骨细胞退变现象的连续观察

　　作者：陈晓东 林建华 作者单位：深圳平乐骨伤科医院，广东 深圳 518010

　　【摘要】 目的 对体外培养大鼠软骨细胞退变现象进行连续观察，为进一步研究软骨退变机制实验及药物干预实验提供基础资料。方法 进行大鼠软骨细胞取材并传代培养，对各代次细胞进行连续性观察，采用倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态与微结构，免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)，阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸糖氨多糖(GAG)含量和结构，反转录-聚合酶链式反应方法检测软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达，观察软骨细胞退变。结果 第四代软骨细胞出现长梭形改变，电镜下超微结构出现核固缩或水肿、细胞器减少或变形等退变表现，PCNA表达百分率明显减少(P<0.01)，GAG含量、长链分子百分比显著减少(P<0.01)，Ⅱ型胶原及Aggrecan　mRNA表达显著减少(P<0.01)。结论 体外培养软骨细胞第四代出现明显功能退变。

　　【关键词】 软骨细胞;退变;增殖;去分化

　　基金项目：福建省科技计划重大资助项目(2004Y018)

　　The continuous observation of chondrocyte degeneration in vitro of rats

　　CHEN Xiao-Dong, LIN Jian-Hua.

　　Shenzhen Pingle Orthopaedic Hospital，Shenzhen 518010, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To provide the basic data for further studying the chondrocyte degeneration mechanism and its drug intervention experiment by observing continuously chondrocyte degeneration in vitro of rats.Methods The chondrocyte of the rats were sampled to subculture and observe. Inverted phase contrast and transmission electron microscopes were used to observe the cell form and microstructure. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was detected by immunohistochemisty. Extracellular glycosaminoglycan (GAG) content and structure were determined by alcian blue staining. Chondrocyte Ⅱ type collagen and aggrecan expression were detected by RT-PCR to observe its degeneration.Results The fourth chondrocyte showed long fusiform shape, karyopyknosis or dropsy, decreased or transfigured generation organelle under electron microscope. The expression rate of PCNA, GAG content and the percentage of long chain molecule and the expressions of Ⅱ type collagen and aggrecan mRNA were obviously decreased (all P<0.01).Conclusions The fourth generation chondrocyte cultured in vitro could have obvious functional degeneration.

　　【Key words】 Chondrocyte;Degeneration;Proliferation;Dedifferentiation

　　关节软骨为特殊的无血管性组织，其主要功能是分泌基质，而软骨细胞为终末分化细胞，在体内基本不通过有丝分裂而增殖，所以软骨损伤很难自愈。应用软骨细胞修复关节软骨缺损有望取得满意效果，但存在软骨细胞来源有限和难以固定而流失等问题。随着组织工程学的提出和确立，对于各种原因导致的关节软骨缺损的治疗有了新的选择，以组织工程软骨修复软骨缺损成为可能的新治疗方法，在选择用于构建组织工程化软骨的种子细胞时，人们自然会想到软骨细胞，但是软骨细胞在体外传代培养过程中会发生退变，表现为增殖能力下降并出现去分化，限制了组织工程软骨的临床应用。本实验就软骨细胞体外传代培养过程中出现的退变现象进行连续观察，旨在进一步研究如何通过药物干预使软骨细胞退变减缓及软骨退变机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、材料与仪器 清洁级SD大鼠(福建医科大学实验动物中心提供，闽验证字20050001，合格证号2005C03)，4周龄，体重180～200 g左右，雄性。αMEM培养基和PBS(Gibco公司)、胎牛血清FBS(HyClone公司);胰蛋白酶1∶250(Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司);二甲基亚砜DMSO(Amersco公司);盐酸胍(GnCl)、阿力新蓝和TritonX-100(上海生工公司);增殖细胞核抗原PCNA(美国NeoMarkers公司)，TRIZOL、RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司，美国)，PCR引物序列：上游 5′-TGGTGCTGCTGACGCTGCTCATCGCCACGGTCCTA-3′，下游5′-GCCTTCTGATCAAATCCTCCAGCCATCTGGGCCGC-3′(340 bp);聚集蛋白聚糖(Aggrecan)引物序列：上游5′-CTGCTACACAGGTGAAGACTTTGTAGACATCC-3′，下游5′-TGCTGTGCCTCCTCAAATGTCAGAGAGTATCT-3′(475 bp);内参照β-actin：上游5′-GAGGCATCCTGACCCTGAAG-3′，下游5′-CATCACAATGCCAGTGGTACG-3′( 274 bp)(上海生物工程有限公司)。HU-12A透射电子显微镜(HITACHI公司，日本)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠软骨细胞的取材、培养、分组 取大鼠8只，断颈处死，参考Hu等〔1〕软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3 d首次换液，8～10 d达85%融合后进行传代培养。以传代次数分组，即原代细胞、第一代细胞，第二代细胞，余类推。

　　1.2.2 倒置相差显微镜下形态学观察 取每代贴壁软骨细胞于倒置相差显微镜观察细胞生长情况。

　　1.2.3 软骨细胞透射电镜观察 取第一、二、三、四代软骨细胞，离心后先于离心管培养3 d，固定、脱水、包埋、聚合、染色在日产Hu-12A型透射电镜下观察并摄片。

　　1.2.4 免疫组化法检测PCNA表达 将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48 h后取出盖玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况，结果分析：①采用HPIAS21000 高清晰度图像处理系统，进行图像分析，计算出各代细胞Ⅱ型胶原阳性信号面积密度(Sv =Ⅱ型胶原阳性信号面积和/窗口面积×窗口数);光镜下每个标本随机选5个高倍视野计数细胞，求出阳性表达率(%)。

　　1.2.5 阿力新蓝染色法检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量及分子结构 配制阿力新蓝贮液，将各代软骨细胞用0.25%胰酶消化、收集、裂解，按照Sven 〔2〕的方法进行反应，以溶解液重溶阿力新蓝，将蛋白聚糖沉淀复合物，移入96孔板中，酶标仪600 nm波长处测定吸光度A值。检测过程中以双蒸水作为空白对照，裂解液作为阴性对照，检测GAG分子结构，将各代软骨细胞取样裂解，各代均分2组，通过调节不同的GnCl浓度，分阶段对链长及硫酸化程度不同的GAG进行定量检测。

　　1.2.6 RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA表达 Ⅱ型胶原表达引物源于Kohno〔3〕文献，采用TRIZOL提取各代软骨细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，-80℃冻存备用。取100 ng总RNA，按一步法RT-PCR试剂盒说明操作，扩增条件如下：94℃变性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸1 min，25次循环，最后72℃延伸2 min后，扩增产物片段长度为340 bp;β-actin：94℃ 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s扩增产物片段长度为274 bp。取5 μl PCR产物在含有1%琼脂糖的0.5×TBE缓冲液中电泳，电压控制在100 V，时间控制在30～40 min。用Gel Doc 2000型凝胶图像分析系统拍照，用Gelworks 1D Intermidiate软件定量分析。

　　1.2.7 RT-PCR法检测Aggrecan mRNA表达 引物来源于Doege 〔4〕文献实验步骤与图像分析同Ⅱ型胶原检测，退火温度55℃，扩增产物475 bp。

　　1.3 统计学方法 以上检测均随机取多个样本，每个样本多次重复。应用SPSS11.0统计软件进行OnewayANOVA检验，定量资料实验结果以x±s表示。

　　2 结果

　　2.1 各代软骨细胞形态观察 原代软骨细胞体积较小，呈三角或多角形，均匀散在生长，折光性强;第一、二代细胞体积变大，呈多角形，小部分细胞形态狭长，折光性良好;第三代细胞逐渐变狭长，折光性减弱;第四代呈长梭型退化改变(图1)。

　　2.2 透射电镜各代软骨细胞微结构观察 第一代软骨细胞体积较大，胞浆内细胞器较多，细胞外胶原纤维较粗且量多，蛋白聚糖较多，未发现凋亡软骨细胞;第二代软骨细胞为三角形或卵圆形，细胞核及核仁清晰，少许异染色质沿核膜均匀分布，核内以常染色质为主。胞浆内有较多糖原颗粒和分泌囊泡，内质网和线粒体较丰富;第三代软骨细胞体积增大，核浆比例加大，胞浆内质网和线粒体减少，胞外基质胶原纤维和蛋白聚糖消失，胶原网络结构模糊不清;第四代细胞体积明显增大，胞浆浓缩致密，但质膜较完整，染色质浓缩并凝结成块，细胞核出现固缩或胀大，出现退变。见图2。

　　2.3 各代软骨细胞PCNA表达 随着传代培养，软骨细胞PCNA表达逐渐减少，各代细胞之间相比较其阳性表达显著降低，第四代阳性表达下降尤为明显(P<0.01)。见图3、表1。

　　图1 光镜下软骨细胞形态变化(×100)(略)

　　图2 软骨细胞超微结构(×10 000)(略)

　　图3 各代软骨细胞PCNA表达(×400)(略)

　　表1 各代软骨细胞PCNA的表达(略)

　　组间比较：1)P<0.01;与前三代各组比较：2)P<0.01，下表同

　　2.4 各代软骨细胞硫酸GAG含量及分子结构 随着传代次数的增加，软骨细胞外基质中硫酸GAG逐渐下降，以长链GAG含量变化显著，第四代时，总GAG含量显著减少，其中长链GAG所占的比例仅为36.4%，第四代细胞的长链/高度硫酸化GAG的绝对含量和相对含量均显著减少，合成减至第一至第三代细胞的50%以下，并且由占GAG总量的68.8%降为36.4%，结果见表2。

　　2.5 各代软骨细胞Ⅱ型胶原表达情况 RT-PCR检测可见从第一代至第四代软骨细胞均可表达Ⅱ型胶原，但其表达量呈递减趋势，第一至四代软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达量吸光度值依次为0.349±0.015，0.334±0.006，0.301±0.014，0.004±0.001，第四代显著减少(P<0.01)，见图4。

　　表2 各代软骨细胞外基质硫酸GAG含量(OD值)(略)

　　β-actin(274 bp)作为内参照;M：1 000 bp DNA ladder;1 第一代组;2 第二代组;3 第三代组;4 第四代组，下图同

　　图4 各代软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA产物RT-PCR电泳图(略)

　　图5 各代软骨细胞Aggrecan mRNA产物RT-PCR电泳图(略)

　　2.6 各代软骨细胞Aggrecan表达情况 见图5。RT-PCR检测可见从第一代至第四代软骨细胞均可表达Aggrecan，但其表达量呈递减趋势，第一至四代软骨细胞Aggrecan mRNA表达量吸光度值依次为0.487±0.007，0.458±0.008，0.448±0.010，0.159±0.001，第四代显著减少(P<0.01)。

　　3 讨论

　　光镜下单层培养的软骨细胞呈角形或梭形，原代培养的软骨细胞排列紧密、折光性强，在传代培养过程中逐渐去分化，形态上发生变化，由原代的多角形细胞形态逐渐变狭长，折光性减弱，第四代以后，均呈长梭型老化;透射电镜观察可发现，青年软骨细胞内存在明显的粗面骨质网及高尔基复合体，细胞周围和细胞间可见网络样结构及少量胶原纤维和蛋白聚糖，第四代细胞体积明显增大，胞浆浓缩致密，但质膜较完整，染色质浓缩并凝结成块，细胞核固缩或胀大，出现退变。

　　PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达和合成与细胞周期有关，主要在增殖细胞的S期、G1期、G2初期表达，因此成为检测细胞增殖活性最为有效的标志之一。本实验结果证实，随着软骨细胞传代复制，PCNA表达呈下降趋势，第四代软骨细胞增殖能力明显减弱。

　　硫酸GAG是软骨细胞外基质中的重要成分之一，是关节软骨的主要成分之一。本实验证实软骨细胞外基质中硫酸GAG含量随软骨细胞传代次数增加呈下降趋势，第四代细胞总GAG含量大幅度下降，且长链GAG含量显著减少。软骨中最丰富的基质是胶原蛋白，其中Ⅱ型胶原含量最高，占胶原蛋白90%以上，是软骨保持结构的紧密性和生物力学特性的基本条件。本研究应用RT-PCR的方法对不同代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达进行检测，证实从第一代至第四代软骨细胞均可表达Ⅱ型胶原，但随传代次数增加，到第四代软骨细胞Ⅱ型胶原表达显著减少。Aggrecan是以核心蛋白(coreprotein)为核心，结合GAG链构成的糖蛋白。蛋白聚糖广泛存在于胞间和胞外基质中，是一种结构复杂的生物大分子，一条核心蛋白主链上连接有上百条GAG侧链，核心蛋白又通过连接蛋白与透明质酸连接，形成一个庞大的网络〔5〕。Loeser等〔6〕研究显示，体外培养软骨细胞Aggrecan光密度比值在第四代开始显著减少，与第四代软骨细胞回植体内较难形成完整的软骨组织相对应。本实验中看到随着体外传代培养从第一代至第四代软骨细胞均可表达Aggrecan，但其表达量呈递减趋势，第四代软骨细胞Aggrecan表达显著减少。

　　综上所述，作为终末分化细胞的软骨细胞体外单层传代培养时第四代即出现明显退变，细胞增殖能力减弱，出现去分化现象。体外单层连续培养的软骨细胞退变老化和体内软骨组织退变直接相关，对这一现象的进一步认识和深入研究有助于对软骨组织工程种子细胞退变和组织工程软骨回植退变现象的认识，从而为进一步探讨软骨细胞退变机制及用药物干预软骨细胞退变提供实验参考。

　　【参考文献】

　　1 Hu DN，Yang PY，Ku MC，et al.Isolation and cultivation of human articular chondrocytes 〔J〕.Kaohsiung J Med Sci，2002;18(3):113-20.

　　2 Sven B.Stimultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue〔J〕.Anal Biochem，1993;210：282-91.

　　3 Kohno K，Martin GR，Yamada Y.Isolation and characterization of a cDNA clone for the amino-terminal portion of the pro-α1(Ⅱ)chain of cartilage collagen〔J〕.J Biol Chem，1984;259：13668-73.

　　4 Doege K，Sasaki M，Horigan E，et al.Complete primary structure of at cartilage proteoglycan core protein deduced from cDNA clones〔J〕.J Biol Chem，1987;　262：17757-67.

　　5 Cargiulo BJ，Cragg P，Richardson JB,et al.Phenotypic modulation of human articular chondrocytes bistratenea〔J〕.Eur Cell Mater，2002;3：9-18.

　　6 Loeser RF，Shanker G.Autocrine stimulation by insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor 2 mediates chondrocytes survival in vitro〔J〕.Arthritis Rheum，2000;43(7)：1552-9.