体外培养大鼠软骨细胞老化的机制初探

　　作者：陈晓东 林建华 作者单位：深圳平乐骨伤科医院，福建医科大学附属第一医院骨科 广东 深圳 518010

　　【摘要】 目的 对体外传代培养的大鼠软骨细胞进行相关因子检测，初步探讨其复制性老化(传代培养出现的老化表现)的机制。方法 对连续培养的第二、三、四代软骨细胞进行实验，采用免疫细胞化学检测p16 、pRb、 E2F、 CyclinD 、CDK4等因子表达水平，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，观察软骨细胞老化过程中各因子的变化。结果 随着细胞复制性老化p16、pRb、CyclinD表达水平显著上升(P<0.01)，E2F、CDK4、端粒酶表达水平显著下降(P<0.01)。 结论 体外培养软骨细胞老化过程与p16、pRb、CyclinD表达增加，E2F、CDK4、端粒酶表达下降密切相关。

　　【关键词】 软骨细胞;老化;机制

　　基金项目：福建省科技计划重大资助项目(2004Y018)

　　Preliminary probe into aging mechanism of chondrocyte in the rats in vitro

　　CHEN Xiao-Dong, LIN Jian-Hua.

　　Pingle Bone Injuries Hospital in Shenzhen, Shenzhen 518010, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To determine the correlated factors of chondrocyte in the rats in vitro to explore its replicative senescence mechanism. Methods The expression levels of p16, pRb, E2F, CyclinD and CDK4 were determined by immunocytochemistry and telomerase activity were detected by TRAP-ELISA in the second, third and fourth generation chondrocytes of consecutive cultivation to observe their changes in senescence process. Results The expression levels of p16, pRb, CyclinD significantly increased (P<0.01), those of E2F, CDK4 and telomerase obviously decreased (P<0.01) with replicative senescence in chondrocytes.Conclusions The senescence process of chondrocyte in the rats in vitro is closely related to the increased expressions of p16, pRb and CyclinD and the decreased expressions of E2F, CDK4 and telomerase.

　　【Key words】 Chondrocyte; Senescence; Mechanism

　　正常人类细胞在体外组织培养的传代过程中，逐渐丧失增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，这一现象是由Hayflick〔1〕等在研究人类二倍体成纤维细胞时最早报道的。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名老化(senescence)，由于老化是由分裂传代而达到的，故将这一过程命名为复制老化(replicative senescence)。软骨细胞属于终末分化细胞，其在体外的传代培养过程中出现增殖停滞，表型丧失，呈老化状态，这种老化属于复制性老化。细胞老化是细胞周期调控下多基因参与的复杂生理病理过程，具有一定的可控性。细胞周期调控因子及老化相关调控因子p16、pRb、CDK、cyclin、E2F、端粒酶等相互作用导致细胞老化。基于本研究的前期实验发现大鼠软骨细胞复制性老化发生在第4代〔2〕，这一发现与Loeser等〔3〕的研究结果一致，本实验将从细胞老化调控因子方面对体外培养的大鼠软骨细胞进行老化机制的初步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　清洁级SD大鼠8只(福建医科大学实验动物中心提供，闽验证字20050001，合格证号2005C03，4周龄，体重180～200 g左右，雄性)。αMEM培养基及PBS(Gibco公司)、胎牛血清FBS(HyClone公司);胰蛋白酶1∶250及二甲基亚砜DMSO(Amersco公司)。SABC免疫细胞化学试剂盒和兔抗大鼠p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4抗体(武汉博士德公司)。TRAP-ELISA试剂盒及抗地高辛过氧化物酶：0.5 U/m1(Boehringer Mannheim 德国)，TMB底物液：3，3′，5，5′-四甲苯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠软骨细胞的取材、培养、分组

　　取SD大鼠8只，断颈处死，参考Hu等〔4〕软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3 d首次换液，8～10 d达85%融合后进行传代培养。 大鼠软骨细胞按传代次数分为第二代组、 第三代组、第四代组(细胞接种密度为0.5×106～1×106，接种6孔板)。

　　1.2.2 免疫细胞化学法检测p16基因、E2F及pRb蛋白、CyclinD、CDK4表达

　　采用链霉亲和素-生物素化过氧化酶复合物(SABC)法：将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48 h。用已知阳性切片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。结果分析：①采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统，计算出各代细胞Ⅱ型胶原阳性信号面积密度(Sv =Ⅱ型胶原阳性信号面积/窗口面积×窗口数);光镜下每个标本随机选5个高倍视野计数细胞，求出阳性表达率(%)。

　　1.2.3 端粒酶的TRAP-ELISA检测

　　①采用德国宝灵曼公司TRAP-ELISA标准试剂盒，TRAP反应试剂(细胞裂解液：含0.5%CHAPS，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟，5 mmol/L巯基乙醇，10%甘油;PCR反应液：20 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，5 mmol/L MgCl2，63 mmol/L KCl，0.005%Tween-20，1 mmol/L EGTA，50 μmol/L dNTP，0.1 μg TS寡核苷酸，序列为5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，TaqDNA聚合酶2 U，牛血清白蛋白0.1 mg/ml，0.03 μg CX引物，序列为5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′)，ELISA试剂〔变性液：0.5 mmol/L NaOH，1.5 mmol/L NaCl;杂交液：地高辛标记端粒探针，20×SSC，10%SDS，5 mg/ml ssDNA(变性断裂鲑精);终止液：5%硫酸〕。②将培养的活力良好的细胞用0.25%的胰酶消化后，在计数板上精确计数2×106个细胞，冷PBS洗2次，以下操作在冰上进行：加裂解液200 μl，冰上反应30 min，16 000 r/min低温离心20 min，取上清5 μl加入TRAP反应液25 μl、DEPC 30 μl，进行PCR扩增，94℃30 s;50 ℃ 30 s;72℃ 90 s，循环33次。同时设阳性对照与阴性对照：阳性对照为人胚肾293细胞株(试剂盒提供)，阴性对照为端粒酶提取物加1 μg/μl RNaseA，37℃孵育20 min;取5 μl扩增产物，加20 μl变性液，室温反应10 min，加杂交液225 μl，充分混匀，将上述混合液体100 μl加入MTP包被微量反应板中，300 r/min摇床、37℃孵育2 h弃去杂交液，PBS清洗3次，每孔中加入100 μl抗地高辛过氧化物酶，300 r/min摇床室温30 min;弃去液体，清洗5次，加100 μl TMB底物液，室温下观察颜色反应。端粒酶阳性时，液体由无色透明逐渐变蓝，弃去TMB底物液后，加入终止液，颜色由蓝变黄。加入终止液后30 min内，在酶标仪上测A值，波长为450 nm(以690 nm波长为参考)根据△A = A450-A690计算细胞端粒酶活性。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS11.0统计软件进行OnewayANOVA检验和Pearson相关分析，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 p16、pRb蛋白及CyclinD免疫细胞化学检测结果

　　第二代组、第三代组、第四代组软骨细胞随代次增加，p16及pRb蛋白和CyclinD的阳性表达显著增加(均P<0.01)。见图1、表1。

　　2.2 E2F因子和CDK4免疫细胞化学检测结果

　　第二代组、第三代组、第四代组软骨细胞随代次增加，E2F因子和CDK4的阳性表达显著减少(均P<0.01)。见图1、表1。表1 免疫细胞化学检测p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4蛋白的表达(略)

　　2.3 端粒酶TRAP-ELISA检测结果

　　阴性对照组端粒酶的表达为0.028±0.002 6，阳性对照组为1.627±0.256 5，表达均呈非阳性表达，第二代组(0.063±0.007 0)、第三代组(0.054±0.005 3)、第四代组(0.042±0.002 5)细胞随代次增加端粒酶表达显著减少(P<0.01)。

　　2.4 相关性分析

　　R值显示：p16、CyclinD、pRb表达呈高度正相关(P<0.01)，E2F、CDK4、端粒酶表达呈高度正相关(P<0.01);此两组之间又呈高度负相关(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　3.1 p16蛋白的作用机制

　　p16通过与CDK4、CDK6结合，阻滞CDK4、CDK6与Cyclin D结合，抑制Cyclin D-CDK复合物的活性，使Rb不能磷酸化，未磷酸化或低磷酸化的pRb能够与多种蛋白结合，其中E2F被Rb结合时，不能发挥转录因子的作用，其活性处于被抑制状态，阻滞细胞进入G1期，从而抑制细胞增殖，随着细胞分裂次数的积累，p16表达逐渐上调，细胞增殖停滞出现老化。近年来研究发现〔5〕细胞衰老时，p16基因的mRNA转录及蛋白表达水平增高，抑制了有丝分裂原刺激产生磷酸化Rb蛋白的作用，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态。因此Stein〔6〕认为p16是细胞寿限的关键调控基因。本实验观察，随着软骨细胞传代培养，p16蛋白的表达呈逐代上升趋势，这说明p16蛋白与细胞衰老直接相关，软骨细胞老化和p16高表达之间的先后关系尚待进一步研究。

　　3.2 pRb因子的作用机制

　　pRb(视网膜神经母细胞瘤蛋白)属于核酸蛋白，有活化的低磷酸化和失活的高磷酸化两种形式存在，低磷酸化的Rb蛋白阻滞细胞于G1期。pRb的活力主要受到磷酸化/脱磷酸化的控制，在细胞周期G0期和G1早期，pRb是以低磷酸化形式存在;在G1、S、G2期和M期，它主要以磷酸化形式存在。G1期CDK主要通过改变pRb的磷酸化状态发挥细胞周期调控作用。pRb能够与其他细胞周期调控蛋白相互作用，并通过所有的3种RNA多聚酶而发挥负调控因子的作用〔7〕。更为重要的是，与转录因子E2F相结合，抑制其活力而引起细胞周期停滞〔8〕。本文观察到，随着传代培养，pRb基因蛋白表达呈显著上升趋势，这说明pRb蛋白与细胞衰老直接相关，实验中检测到的pRb系低磷酸化和磷酸化的综合，其低磷酸化所占比例仍不十分清楚，尚有待深入研究。

　　3.3 E2F的作用机制

　　E2F家族的转录因子能够调控许多在细胞周期前进过程中起重要作用的基因表达。E2F与细胞周期通过G1/S期检测点及细胞增殖直接相关。低磷酸化的pRb能够与E2F相互作用，并且这种作用可能与衰老细胞不能表达E2F相关的G1晚期蛋白，使之不能通过G1/S点有关〔5〕。本实验观察到，随着传代培养，软骨细胞E2F基因的表达呈现明显下降趋势，这说明E2F转录因子与细胞衰老有相关性，其表达下降可能与pRB的表达量增加有关，其与其目的基因的相互关系尚需进一步研究。

　　3.4 CyclinD的作用机制

　　CyclinD为细胞周期中G1期进入S期的一个重要调控因子，通过激活CDK4或CDK6等作用，促进DAN合成，加速细胞增殖。调节CyclinD的因子主要是CDK4，在少数细胞中是CDK6。CyclinD-CDK复合物在G1期中R点中起调节作用〔9〕。在G1期，CyclinD1与CDK4(有些为CDK6)结合，使后者激活，活化的CDK4可使Rb磷酸化，并且优先磷酸化组蛋白Rb。同时，CyclinD1合成和激活所导致的Rb蛋白磷酸化，将在G1期末形成一个负反馈，关闭CyclinD1的表达。本实验观察到，随着传代培养，软骨细胞CyclinD的表达呈现上升趋势，其原因可能是p16特异地与CDK4结合，阻止CDK4与CyclinD形成复合物有关，所以CyclinD1合成没有受到负反馈调节，故随着细胞衰老，CyclinD1蛋白表达水平增加。

　　3.5 CDK4的作用机制

　　CDK4为周期素依赖激酶4，主要参与调节细胞从G1期向S期的过渡。研究表明一方面老化细胞表达CDK4水平下降;另一方面，由于p16抑制CDK4的活性，阻断转录抑制因子Rb的磷酸化，导致与Rb蛋白结合的转录活化因子E2F1不能释放，使细胞循环至S期所必需的许多重要基因不能激活，引起细胞生长阻滞于G1期，从而诱发细胞衰老的特征性改变〔10～12〕。本实验中看到，随着传代培养，软骨细胞CDK4的表达呈现显著下降趋势，说明软骨细胞老化与CDK4的表达直接相关，其低表达可能与细胞老化p16的表达量增加，CDK4被p16结合抑制其活性表达有关，或者与其通过其他通道失活有关，这有待于进一步研究。

　　3.6 端粒酶的作用机制

　　端粒酶是RNA依赖的DNA多聚酶，合成端粒的DNA序列，是细胞具有无限增殖潜能的分子基础。它由两个亚单位组成：RNA亚单位(hTR)和催化亚单位(hTERT)。hTR的功能是作为端粒DNA合成的模板，而hTERT具有逆转录酶的活性，其在正常细胞中被抑制而在永生化细胞中表达上升。因此在大多数体细胞中均无端粒酶活性，因而导致细胞体外有限的增殖能力。端粒酶的功能主要在于合成染色体末端的重复序列，以维持端粒的长度和稳定性。Bondnar等〔13〕在两种人类端粒酶负责表达的体细胞(视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞)中已经表达了hTERT基因，研究结果表明，hTERT载体的克隆在这些细胞中表达了端粒酶的活性，并使他们的寿命延长了至少20代，其水平可与永生化细胞内的活性相媲美，且细胞老化的生物学标记β-半乳糖苷酶的表达也显著减少，而细胞的核型保持正常。因此，在正常的人体细胞中适当地激活端粒酶活性可延长细胞的寿命并有抗老化的作用。本次实验观察到，软骨细胞端粒酶的表达呈微弱表达，这说明软骨细胞作为终末分化细胞其端粒酶活性基本处于未激活状态，如何激活或者适当增加端粒酶活性可能是逆转或防治细胞老化的方法之一，这有待于进一步研究。

　　综上所述，在软骨细胞发生复制性老化时，细胞周期调控因子及老化相关调控因子的表达出现了一定的趋向性，实验结果同有关细胞老化的实验研究相符合，证明了实验的科学性，这一方面说明这些因子在细胞老化中发挥了作用，另一方面也为我们提出了新的研究点，即是否可以通过药物干预改变调控因子的表达来改变软骨细胞的老化。

　　【参考文献】

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　　2 林建华，陈晓东，邓凌霄，等.大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察〔J〕.中国修复重建外科杂志，2007;21(11):1155-60.

　　3 Loeser RF，Shanker C.Autocrine stimulation by insulin-like growth factor1 and inslin-like growth factor2 mediates chondrocytes survival in vitro〔J〕.Anhritis Rheum，2000;43(7)：1552-9.

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　　13 Bondnar AG，Ouellette M，Frolkis M,et al.Extention of life-span by introduction of telomerase into normal human cells〔J〕.Science，1998;279：349-52.