雌激素缺乏对大鼠股骨骨髓细胞Fas、FasL表达的影响
发表时间：2010-07-23 浏览次数：456次
作者：王松 沈霖 杨月琴 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合骨科，湖北 武汉 430079
【摘要】 目的 探讨去势后SD大鼠骨质疏松发生过程中股骨骨髓细胞Fas、FasL的表达情况。方法 建立绝经后骨质疏松模型(去势组，切除双侧卵巢)。用免疫组织化学方法(SABC法)检测不同时期去势大鼠与正常大鼠股骨骨髓细胞Fas、FasL的表达情况。结果 在SD大鼠去势后骨质疏松发生过程中股骨骨髓细胞Fas、FasL的表达呈现出下降的趋势，并且破骨样前体多核细胞都呈弱阳性表达;而非去势组大鼠股骨骨髓细胞Fas、FasL呈强阳性表达，并且这种强阳性的表达多局限于破骨样前体多核细胞的胞浆中。结论 在雌激素缺乏的情况下，骨髓细胞Fas、FasL的表达减弱;雌激素能加强骨髓破骨样前体多核细胞Fas、FasL的表达，从而引起骨髓中破骨样前体多核细胞凋亡的发生。
【关键词】 骨质疏松;雌激素;Fas;FasL
Effects of estrogen deficiency on expressions of Fas and FasL in femoral bone marrow cells of SD rats
WANG Song, SHEN Lin, YANG Yue-Qin.
Orthopedics of Integrated Traditional and Western Medicine, Union Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430079, Hubei, China
【Abstract】 Objective To observe the expressions of Fas and FasL in femoral bone marrow cells of ovariectomized SD rats and normal SD rats. Methods Immunohistochemical ABC methods was used to determine Fas and FasL in femoral bone marrow cells of osteoporosis rats and controls. Results Expressions of Fas and FasL in femoral bone marrow cells of ovariectomized SD rats decreased during the development of osteoporosis, and the expressions of Fas and FasL in pre-osteoclast-like-cells were low; Expressions of Fas and FasL in femoral bone marrow cells of control group were high, and most of Fas and FasL were located in endochylema of pre-osteoclast-like-cells.Conclusions Expressions of Fas and FasL are low in the condition of estrogen deficiency; Estrogen is able to increase the accounts of Fas and FasL in pre-osteoclast-like-cells, inducing pre-osteoclast-like-cells apoptosis.
【Key words】 Osteoporosis; Estrogen; Fas; FasL
在整个生命周期中，骨质在不停的形成(成骨)和破坏(破骨)，维持着一种动态平衡。在绝经后骨质疏松发生过程这种动态平衡受到破坏，破骨细胞的生理功能加强,而成骨细胞的生理功能减弱,最终引起骨质的丢失。大量的研究集中在雌激素缺乏引起骨吸收因子IL-1、IL-6的生成而使破骨细胞的破骨功能加强〔1〕，雌激素的作用可引起骨形成因子TGF-β、IGF-1的生成而使成骨细胞的骨形成功能加强等方面〔2〕。然而，雌激素对骨髓细胞凋亡的影响如何。在雌激素的作用下，是否有Fas及Fas配体(FasL)介导骨髓中破骨样前体多核细胞细胞凋亡的发生;同时在雌激素缺乏的情况下，骨髓细胞中Fas及Fas配体(FasL)的表达又如何，本研究旨在探讨雌激素与骨髓细胞中Fas及Fas配体(FasL)表达之间的关系。
1 材料与方法
1.1 骨质疏松模型的建立 选取28只4月龄雌性SD大鼠(普通级)，体重(250 ±10)g。随机分为4组，每组7只，其中3组为去势组，另一组为假手术组(对照组)。各组动物分笼饲养，自由摄取食物和水，经2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后，去势组进行双侧卵巢切除，对照组动物单纯切开，关腹。
1.2 标本收集与制作 于术后4、8、12 w时麻醉处死一组大鼠，剖取大鼠股骨近端1.5 cm长骨块，固定于10%中性甲醛-生理盐水溶液中48 h，然后5%EDTA(pH7.6)溶液脱钙3 w左右，待脱钙完成后，按常规方法进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，纵向切片(6 μm)，常规HE染色。
1.3 免疫组化染色 FN免疫组化染色采用SABC技术，兔抗鼠FN及SABC试剂盒均为Boster产品，一抗工作浓度为1：200，在40℃反应12 h后加生物素标记的二抗，室温30分钟，加SABC复合物室温30 min，然后常规DAB显色，苏木素复染后脱水、透明、封片。用0.1%PBS代替一抗进行对照实验。
1.4 统计学处理 用SPSS统计软件对组间灰度值数据作单因素分析。
2 结果
2.1 光镜观察 对照组骨髓细胞中Fas及FasL呈强阳性表达，并且这种强阳性表达主要局限在破骨样前体多核细胞的胞浆中及细胞膜上(图1)。去势4、8、12 w骨髓细胞中Fas及FasL的表达呈弱阳性，并且这种弱阳性表达多分散在骨髓中单个核细胞的胞浆中，在破骨样前体多核细胞Fas及FasL呈弱阳性表达,并且这种弱阳性表达随去势后时间的延长(绝经后骨质疏松症进展中)有着明显下调趋势(表1)。
2.2 骨髓细胞FN表达的灰度值 见表1。去势后不同时期SD大鼠骨髓细胞Fas及FasL表达的灰度值均大于对照组，即对照组骨髓细胞FN的表达明显强于去势组，它们之间有显著性差异,并且随去势后时间的延长它们的表达有着明显下调趋势。
A：正常对照组Fas强阳性染色 B：正常对照组FasL强阳性染色 C：去势4 w Fas阳性染色 D：去势4 w FasL阳性染色 E：去势12 w Fas弱阳性染色 F：去势12 w FasL弱阳性染色
图1 Fas及FasL免疫组织化学染色(×400)(略)
表1 Fas、FasL表达的灰度值(略)
与对照组比较：1)P<0.05
3 讨论
Fas属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，它为I型跨膜糖蛋白，大多以膜受体形式存在。上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞有较高水平的Fas表达，通过转录水平不同而拼接产生可溶性Fas分子(sFas)。FasL属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，它为Ⅱ型跨膜糖蛋白，分胞外区、疏水跨膜区及胞内区。在正常组织中表达具有特异性，主要存在于成熟的CD4、CD8阳性激活的T淋巴细胞、激活的自然杀伤细胞(NK)和眼、睾丸、中枢神经系统等免疫赦免区域。Fasl膜外区也可通过基质金属蛋白酶(MMP)介导的蛋白水解而产生可溶性FasL(sFasL)进入循环系统。Fas与天然配体Fasl结合，FasL通过与膜型Fas交联而介导表达Fas的细胞发生凋亡〔4,5〕。
本研究观察到非去势组骨髓细胞中Fas及FasL呈强阳性表达，并且这种强阳性表达主要局限在骨髓中某些单个核细胞及即将融合的多个单核细胞或破骨样前体多核细胞的胞浆中及细胞膜上，破骨细胞是造血源性单核细胞前体细胞融合而成〔6～8〕，提示雌激素能加强骨髓中某些单个核细胞及即将融合的多个单核细胞或破骨样前体多核细胞Fas及FasL的表达，这种强表达能诱导本细胞发生凋亡(这种作用方式如同细胞因子的自分泌作用方式)，从而使得破骨细胞凋亡发生过多过早，最终骨髓组织中破骨细胞形成的数量减少来降低骨质的丢失。同时也观察到去势组骨髓细胞中Fas及FasL的表达与非去势组相比明显的较弱，这种弱阳性的表达主要局限在骨髓中某些单个核细胞中。另外，即将融合的多个单核细胞或破骨样前体多核细胞的胞浆中及细胞膜上的表达随去势后时间的延长而逐渐下调，提示在缺乏雌激素的情况下，那些即将融合的多个单核细胞或破骨样前体多核细胞Fas及FasL的表达减弱，从而引起骨髓中破骨样多核细胞的凋亡率降低最终导致大量的破骨细胞形成，这样骨质丢失加快、增多。
雌激素影响着骨髓细胞Fas及Fas的表达，绝经后骨质疏松发生过程中由于雌激素的缺乏，骨髓细胞中Fas及FasL 表达下调，破骨细胞形成的数量增加破骨活性加强;在有雌激素的作用下，雌激素可能与细胞膜上的雌激素受体相互作用激活了胞内其他信号分子，这激活的信号分子又加强了Fas及FasL的转录及合成，最终介导破骨细胞凋亡发生过多过早。这种激活的中游信号分子是什么?雌激素、信号分子、凋亡三者之间又是如何作用等问题还有待于进一步深入研究。
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