臭氧治疗对家兔骨性关节炎病变及NO含量的影响
发表时间：2010-07-13 浏览次数：433次
作者：王林， 王大寿， 穆琼， 姚旌， 陆巍， 沃春新 作者单位：(贵阳医学院附院 疼痛科， 贵州 贵阳 550004) 贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字【2007】2103)。
【摘要】 目的： 探讨臭氧治疗对家兔骨性关节炎(OA)关节冲洗液中NO含量的影响。方法： 40 只新西兰兔随机分为5组，A组为正常对照组，B组为模型对照组，C、D、E组分别为臭氧(20、40、60 mg/L)治疗组;用Vandman法造模型成功后，将不同浓度的臭氧注射入C、D、E组兔膝关节腔内，每3天1次，连续2次;检测关节冲洗液中NO的含量，观察关节软骨的病理变化并进行病理评分。结果： B组软骨呈典型的OA改变，C、D组关节软骨可见不同程度修复，病理评分与B组相比有显著性差异(P<0.01或P<0.05);E组未见明显修复，病理评分与B组无显著差异;与A组相比，B组关节冲洗液中NO含量显著增高(P<0.01);与B组相比，C、D治疗组NO含量显著降低(P<0.01)，E组NO显著增高(P<0.01)。结论： 20～40 mg/L浓度的臭氧可促进实验性OA关节软骨修复，其机制可能与抑制NO生成有关，60 mg/L浓度的臭氧无软骨修复作用。
【关键词】 骨关节炎; 臭氧; 软骨，关节; 一氧化氮; 兔
The Impact of Ozone Treatment to Rabbits Osteoarthritis and NO Contents
WANG Lin, WANG Dashou, MU Qiong, YAO Jin, LU Wei, WO Chunxin
(Department of Pain Management, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004，Guizhou, China)
[Abstract] Objective: To explore the impact of ozone treatment to rabbit osteoarthritis (OA) and NO contents in joint flushing fluid (JFF). Methods： Forty New Zealand rabbits were randomly divided into five groups: normal control group (group A ), model control group (group B), and treatment groups C, D, and E which were treated with ozone at doses of 20 μg/ml, 40 μg/ml, and 60 μg/ml respectively. Models were established with Vandman method successfully, and different doses of ozone were injected into rabbit knee joint cavity of groups C, D, and E twice a week. NO contents in JFF and articular cartilage variation were determined and pathological changes in arthrodial cartilage were observed and analyzed. Results： Typical OA changes in cartilage were found in group B, while different degrees of repairing on articular cartilage could be seen in groups C and D of which the pathological scores differed from that of group B significantly (P<0.01,P<0.05), No obvious repairing was found in group E, of which the pathological score did not differ from that of group B. NO content in JFF was significantly higher in group B than in group A (P<0.01); NO contents in JFF of groups C and D were obviously lower than that in group B (P<0.01) , while in group E, NO content significantly increased (P<0.01). Conclusions： Ozone with concentrations of 20～40 μg/ml can promote articular cartilage repair in experimental OA, and its mechanism may relate to inhibiting NO generation. Ozone of 60 μg/ml has not repairing effect to cartilage.
[Key words] osteoarthritis; ozone; cartilage, articular; nitric oxide; rabbits
骨性关节炎(osteoarthritis OA)是一种慢性进行性关节炎症，随人口老龄化，OA发病率呈逐年上升趋势，严重影响了老年人健康及生活质量。由于OA发病机制目前还不十分清楚，虽然治疗方法很多，但各种疗法均有其局限性，不能从根本上治愈OA[1]。大量研究表明，一氧化氮(NO)可能是导致关节软骨退变的病因之一，而臭氧治疗是近年引进国内的一种方法，对OA的临床疗效满意[2]，但其作用机制尚不十分清楚。2008-2009年通过对臭氧治疗实验性OA后关节冲洗液中NO含量检测，探讨臭氧的作用机制，为臭氧在临床广泛、合理应用寻找理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
选用8～14月龄、体重2.5 kg成年新西兰兔40只(雌雄不限)，由贵阳医学院实验动物中心提供。将动物随机分为5组，每组8只，正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、臭氧20 mg/L治疗组(C组)、臭氧40 mg/L治疗组(D组)及臭氧60 mg/L治疗组(E组)。
1.2 仪器及试剂
德国HAB，IIaB型臭氧发生仪，NO药盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 方法
1.3.1 骨性关节炎模型复制
除正常对照组不造模外，其余4组采用Vandman[3]法将实验动物左膝关节用石膏固定于伸直位,固定范围从兔踝关节下3 cm至腹股沟以下1.5 cm，踝背屈30°～40°，固定时间6周。单笼饲养，不定时强迫家兔运动。
1.3.2 臭氧治疗
造模6周后拆除石膏，将左膝剃毛消毒后，C、D、E组分别取1 ml相应浓度臭氧注入关节腔组，A组及B组则注射1 ml空气，每3天1次，连续两次，第二次给药后72 h用空气栓塞法处死家兔。
1.3.3 关节冲洗液NO含量检测
于第二次臭氧治疗后48 h、用毕胜等[4]采集关节腔冲洗液的方法收集关节冲洗液，平均回收量0.8 ml，置于-20 ℃低温冰箱中保存待测;用硝酸还原酶法检测家兔关节冲洗液中NO含量。
1.3.4 病理检查
取左膝关节胫骨平台全层软骨组织制成0.3 cm×1 cm×0.2 cm薄片，A.F液固定12～24 h，5%硝酸溶液脱钙3 d后放入5%明矾中12 h，流水冲洗12 h，石腊包埋切片，参照C.Colombo关节软骨病理评分标准[5]行病理积分统计。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.5软件进行统计处理，计量资料以(x±s)表示。组间比较采用方差分析和q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理变化
A组关节软骨外观呈蓝白色，色泽明亮，无裂纹及软化，关节内少许清亮滑液;光镜下关节软骨四层结构清晰可辨，软骨细胞排列整齐，潮线完整;B组软骨表面碎裂，软骨细胞增生，软骨面见裂隙及软骨硬化;C、D组关节软骨病变较B组明显减轻，而E组与B组相似(见图1)。各组病理积分统计(表1)结果显示，B组病理积分较A组明显升高(P<0.01);C、D组与B组相比，病理积分显著降低(P<0.01，P<0.05)，E组与B组病理积分比较无差异(P>0.05)。表1 各组家兔关节软骨病理积分及关节冲洗液中NO含量(略)
2.2 关节冲洗液中NO 含量
见表1。与A组相比，B组NO 含量显著增高(P<0.01);与B组相比，C、D组NO 含量显著降低(P<0.01)，而E组NO 含量显著增高(P<0.01)。图1 各组家兔膝关节软骨病理变化(×100，HE染色)
3 讨论
OA病变主要集中于关节软骨和软骨下骨，关节软骨退变是OA重要标志。关节软骨由软骨细胞和软骨基质共同组成，前者仅占软骨总量的1%，但却负责分泌软骨基质中的成分，软骨基质由胶原、蛋白聚糖及水组成，具有传导载荷吸收震荡、润滑关节的功能。当发生OA后，关节软骨进行性变性、糜烂、破坏及骨赘形成。本实验模型组关节软骨呈现典型OA改变，表现为软骨表面碎裂缺损，软骨细胞增生成簇，软骨变薄;臭氧20 mg/L治疗组及臭氧40 mg/L治疗组关节软骨病理改变有明显修复，提示20～40 mg/L臭氧关节腔注射可通过促进关节软骨修复达到治疗作用，而60 mg/L臭氧对关节软骨病理改变无影响，且有加重趋势。
NO是一种气体自由基，机体多种细胞均能产生，具有活跃而广泛的生物学性质，是一种高反应性细胞毒性物质，对细菌、肿瘤细胞产生杀伤作用，同时也对正常组织造成损伤。许多研究显示，实验性OA时NO水平显著增高，以软骨及滑膜中含量最高，并推测NO含量升高成为关节软骨退变和滑膜炎症病因之一[6]。基质金属蛋白酶(MMP)是促进关节软骨基质降解的最重要物质，研究认为高浓度NO可通过刺激MMP活性来增加胶原和蛋白聚糖裂解以及使PGE升高而导致软骨基质破坏[7,8]。此外，NO可扩张微血管，提高微动脉血管渗透性，促进细胞因子和PGE等释放产生炎症现象，对炎症疾病的发展和维持起着重要作用。已有研究表明，NO抑制剂能明显改变动物关节模型中关节的损伤程度和病程，抑制炎症及组织损害[9，10]。因此对体内NO的调控有助于改善OA的病情。本实验模型组关节冲洗液中NO含量明显增高，与文献报道一致，用20～40 mg/L臭氧治疗后，关节冲洗液中NO含量显著减少，且关节软骨病损有明显修复，提示该浓度臭氧可能通过抑制NO的生成，调节软骨合成与分解代谢平衡而起治疗作用;而60 mg/L臭氧治疗后关节冲洗液口NO含量比模型组显著增高，同时病理改变亦显示软骨无修复迹象，甚至有加重趋势，表明60 mg/L臭氧对OA炎性疾病有加重作用，不利于软骨修复，甚至可能有破坏作用，不宜用于治疗。
综上所述，NO含量升高可能导致关节软骨退变，而臭氧可能通过抑制NO的表达，减轻炎症反应及关节软骨分解，从而阻断OA的发展。臭氧浓度的不同显示其具有不同生物学效应，高浓度臭氧可能会加重OA软骨损伤，因此，臭氧用于临床应重视其治疗窗的选择。
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