重组人促红细胞生成素对兔脊髓缺血/再灌注损伤的作用

　　作者：徐能，蒋富贵，朱立帆，杨惠林，朱晓东 作者单位：1.吴江市第一人民医院骨科，江苏吴江215200;2.苏州大学附属第一医院骨科，江苏苏州215006

　　【摘要】目的 探讨重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对兔脊髓神经细胞缺血/再灌注损伤的作用及其可能的作用机制。方法 40只健康成年新西兰大白兔随机分为4组:假手术组(A组)，对照组(B组)，小剂量(1000 U/kg)rHuEPO组(C组)，大剂量(3000 U/kg)rHuEPO组(D组)，每组10只。建立兔脊髓缺血/再灌注损伤模型，通过兔耳缘静脉B组注射生理盐水3 ml/kg，C、D组注射相应剂量rHuEPO。分别于缺血/再灌注损伤后4 h、8 h、24 h、48 h、7 d对动物进行后肢运动神经功能评分。7 d时处死动物，取L3～5节段脊髓组织行病理学检查，用苏木精-伊红染色观察脊髓标本的一般病理学改变及脊髓前角运动神经元数量变化;TUNEL法检测脊髓前角运动神经元凋亡情况。结果 缺血/再灌注损伤后各时间点，C、D组后肢运动神经功能评分明显优于B组(P<0.01)，但低于A组(P<0.01)。伤后4 h和7 d评分C组低于D组(P<0.05)。伤后7 d苏木精-伊红染色显示脊髓组织病理学改变C、D组明显轻于B组，较A组严重。伤后7 d脊髓前角运动神经元计数C、D组明显高于B组(P<0.01)，但低于A组(分别为P<0.01和0.05)，D组高于C组(P<0.05)。伤后7 d脊髓前角运动神经元的凋亡指数C、D组明显低于B组(P<0.01)，D组低于C组(P<0.05)。结论 rHuEPO具有抗凋亡作用，对脊髓由于缺血而引起的神经运动功能损害具有保护作用。

　　【关键词】 促红细胞生成素 脊髓 缺血/再灌注损伤 凋亡

　　The effect of recombinant human erythropoietin on spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits

　　XU Neng1, JIANG Fugui1, ZHU Lifan1, YANG Huilin2, ZHU Xiaodong1

　　(1.Department of Orthopedics, the First People′s Hospital of Wujiang, Wujiang, Jiangsu 215200, China;

　　2.Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou, Jiangsu 215006)

　　Abstract: Objective To probe into the effect of recombinant human erythropoietin (rHuEPO) treatment on spinal cord ischemia/reperfusion injury and to explore its possible mechanism. Method Forty healthy adult New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups (n=10 each): Sham Group (Group A), control group (Group B), Small Dose (1000 U/kg) rHuEPO group (Group C), Large Dose (rHuEPO 3000 U/kg) group (Group D). The spinal cord ischemia-reperfusion model of rabbits was established by clamping the infrarenal aorta of rabbits for 30 minutes before releasing for reperfusion. 3 ml/kg of normal saline in Group B and the same dose of rHuEPO in Groups C and D were administrated via rabbit auricular veins respectively except for Group A. Following reperfusion, evaluation of the motor nerve functions in the hind limbs was performed at the times of 4 h, 8 h, 24 h, 48 h and 7 d. On 7 d, the animals were sacrificed and their spinal cords (L3-5) were removed for histopathologic examinations, including hematoxylin and eosin staining for pathological changes and the variations in the amount of motor neurons of the spinal anterior horn. TUNEL was further employed to determine the apoptosis of motor neurons of the spinal anterior horn. Results At each time point after I/R injury, the values of motor nerve function of hind limbs in each rHuEPO group were higher than the control group (P<0.01), but were lower than the Sham Group (P<0.01). 4 h and 7 d after injury, the values were lower in Group C than in Group D (P<0.05). 7 d after injury, hematoxylin and eosin staining revealed a markedly less serious histopathological change of the spinal cord in groups C and D than in Group B, but was more serious than in Group A; the spinal anterior horn neuron counts in groups C and D were significantly higher than that in the control group (P<0.01), but were lower than Group A (P<0.01 and P<0.05 respectively); the apoptosis index of the spinal anterior horn motor neurons in groups C and D was markedly lower than in Group B, and was lower in Group D than in Group C (P<0.05). Conclusion rHuEPO may have anti-apoptosis effect, hence the protective effect on the ischemia/reperfusion injuries to motor neuron functions.

　　Key words: erythropoietin; spinal cord; ischemia/reperfusion injury; apoptosis

　　促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是促进红细胞生成、增加红细胞能量的主要激素，已广泛应用于刺激红系前体细胞的增殖、分化及成熟。近来，Junk等[1]研究表明EPO具有重要的促神经生长及神经细胞的保护作用[1]。本文通过建立兔脊髓缺血/再灌注损伤模型，观察重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin， rHuEPO)对缺血/再灌注损伤后兔脊髓神经细胞的作用，并探讨其可能的作用机制，为进一步研究和临床应用提供基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组 健康3～5月龄新西兰大白兔(苏州大学医学院实验动物中心提供)40只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不拘，随机分为假手术组(A组)，对照组(B组)，小剂量(1000 U/kg)rHuEPO组(C组)，大剂量(3000 U/kg)rHuEPO组(D组)，每组10只。

　　1.2 动物模型的制备 采用Zivin等[2]的脊髓缺血/再灌注损伤模型制备方法，无菌条件下做左背外侧切口，逐层切开，自腹膜后间隙显露出左肾动脉，于左肾动脉下方0.5～1 cm处用无损伤血管夹夹闭腹主动脉。夹闭前经耳缘静脉给予肝素500 U，术中用加热垫维持直肠温度(38.0±0.5)℃。假手术组10只仅显露出腹主动脉段后即缝合伤口，其余3组夹闭30 min后松开血管夹行再灌注。

　　1.3 给药方法 缺血/再灌注开始后30 min，C组、D组分别按1000 U/kg、3000 U/kg剂量耳缘静脉注射rHuEPO(注：10000 U rHuEPO为10 ml)，B组按3 ml/kg耳缘静脉注射生理盐水。A组不给药。所有动物术后肌内注射庆大霉素0.3 ml(1.2mg)。

　　1.4 标本制备 再灌注7 d后，兔被再次麻醉，取俯卧位，后正中切开皮肤，剥离椎旁肌，咬除椎板，暴露硬膜囊，迅速取出L3～L5节段的脊髓组织，置于10%中性甲醛溶液中固定72 h后取出，常规石蜡包埋，连续切片制成5 μm厚薄片，每只动物20张切片。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 后肢运动神经功能评分 于术后4 h、8 h、24 h、48 h、7 d各组动物进行后肢运动神经功能评分。参照Jacobs等[3]评分标准：0级——全瘫;1级——严重不全瘫痪;2级——功能活动，不能跳动;3级——跳动，但共济失调;4级——跳动，轻度共济失调;5级——正常。

　　1.5.2 脊髓组织病理学检查 苏木精-伊红染色观察缺血/再灌注损伤后7 d脊髓组织形态学改变，并根据Rexed[4]脊髓灰质分区标准行脊髓前角运动神经元计数，每张切片光镜下(×100)选择5个具有代表性的脊髓前角视野。

　　1.5.3 神经细胞凋亡的检测 运用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口标记法(TUNEL)染色观察缺血/再灌注损伤后7 d脊髓神经细胞凋亡及其变化。具体步骤按照说明书进行。结果判断以细胞核或细胞质呈棕黄色颗粒状为TUNEL阳性细胞，每张切片光镜下(×100)选择10个具有代表性的脊髓前角视野，计算阳性神经细胞和阴性神经细胞数，并计算凋亡率。神经细胞凋亡率=〔阳性神经细胞数/(阳性神经细胞数+阴性神经细胞数)〕×100%。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，结果以±s表示，P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 后肢运动功能Jacobs评分 再灌注后4 h，B、C、D组动物均出现不同程度的瘫痪;再灌注后8 h内，3组Jacobs评分逐渐升高;再灌注后8～48 h，部分动物出现二次瘫痪，B组中有7只动物出现此现象，Jacobs评分平均降低1～2级，C、D组各有5只动物出现此现象，Jacobs评分由3级降为1级。再灌注后4 h、8 h、24 h、48 h、7 d各时间点Jacobs评分C、D组明显优于对照组(P<0.01)。再灌注后4 h及7 d，D组Jacobs评分优于C组(P<0.05)，但其他时间点C、D组之间Jacobs评分差异无显著性(P>0.05)。见表1。表1 各组各时间点动物后肢运动神经功能评分

　　2.2 再灌注后7 d组织病理学观察 A组脊髓神经细胞轮廓清晰，极性存在。整个组织结构完整、清楚，无中性粒细胞浸润，无出血、水肿等异常现象(图1A)。B组神经细胞固缩，组织水肿严重，中性粒细胞浸润明显，灰质区大部分神经细胞变性坏死，灰质和白质内均有大面积出血灶，边缘胶质细胞增生，形成少量瘢痕(图1B)。C、D组出血灶较对照组依次缩小，灰质区正常神经细胞数目明显增多(图1C、D)。C、D组脊髓前角运动神经元计数较B组明显增加(P<0.01);D组脊髓前角运动神经元计数明显高于C组(P<0.05)。见表2。

　　2.3 再灌注后7 d神经细胞凋亡检测结果 各组脊髓组织中均可检测到TUNEL阳性细胞，凋亡细胞广泛分布于白质和灰质内，既有神经细胞，也有神经胶质细胞。A组仅见少量TUNEL染色阳性细胞(图2A);B组TUNEL染色见到较多细胞核染成棕黄色的阳性细胞(图2B);C组见部分神经细胞凋亡，较多胶质细胞凋亡(图2C);D组偶见神经细胞凋亡，部分胶质细胞凋亡(图2D)。与B组比较， C、D组脊髓前角运动神经元细胞凋亡指数明显降低(P<0.01)。D组神经细胞凋亡指数低于C组(P<0.05)。见表2。表2 再灌注后7 d各组脊髓前角运动神经元计数及凋亡指数的比较

　　3 讨 论

　　EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，rHuEPO与啮齿类动物EPO具有80%同源性[5-6]。研究表明EPO通过与其相应受体(EPO-R)的结合发挥神经保护作用[7]。Celik等[8]对人的脊髓进行免疫组织化学染色发现其毛细血管内、白质和前角运动神经细胞中存在大量具有免疫活性的EPO-R。在应激时如缺血、缺氧状态下EPO-R的表达将明显增加，且至少在24 h内将维持一个很高的水平[9]。因此，在中枢神经系统应激时如缺血、缺氧状态下通过输注外源性的rHuEPO能起到一定的神经保护作用[10]。本实验观察到在兔脊髓缺血/再灌注损伤模型通过耳缘静脉输注外源性的rHuEPO，其残存的前角运动神经细胞计数明显多于对照组，且后肢运动神经功能较对照组亦有显著改善。

　　脊髓神经细胞在脊髓缺血/再灌注损伤后主要表现为细胞的坏死和凋亡。目前认为rHuEPO对神经细胞的保护作用主要得益于对这2种方式的双重阻断[10]。Wen等[11]通过实验发现，在沙鼠脊髓缺血/再灌注损伤后，内源性EPO的分泌由于炎症因子的作用而受到显著抑制。但是，炎症因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等，使沙鼠受损脊髓神经细胞中EPO-R的表达水平大大增加，此时通过输注外源性的EPO对受损神经细胞将有很好的保护作用[10]。在应用rHuEPO后，脊髓缺血/再灌注损伤后缺血区域的炎症因子如TNF、IL-6在缺血区域聚集的浓度将减少50%[5]。与此同时，EPO能通过激活抗凋亡基因Bcl-x和Bcl-2并减少炎症反应来抑制神经细胞的凋亡[11]。实验证实EPO在大鼠体内外均具有抗凋亡作用，EPO能使受损脊髓区域的TUNEL阳性细胞明显减少[6]。本实验观察到rHuEPO各剂量组在脊髓缺血/再灌注损伤后，其组织水肿程度、出血灶范围、中性粒细胞浸润程度较对照组明显减轻，脊髓前角运动神经元凋亡指数较对照组明显降低。

　　通过本实验研究，我们认为：rHuEPO预处理对脊髓缺血/再灌注损伤有一定的保护作用，但其治疗的具体时间窗仍有待进一步探讨。需要指出的是，由于EPO用于治疗神经损伤所需的剂量远大于其治疗贫血时所需的剂量，因此，可能会产生一些不良反应。Ng等[12]报道，在大剂量使用rHuEPO的急、慢性肾功能衰竭患者中，流感样症状、血压增高、血栓形成等并发症并不少见。今后的研究中，关于不含唾液酸的EPO(asialoerythropoietin)选择性促进神经保护而不是红细胞生成的临床研究将是非常有前途的[13]。

　　【参考文献】

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　　[2] Zivin JA， DeGirolami U. Spinal cord infarction: a highly reproducible stoke model [J]. Stroke，1980，11(2):200-202.

　　[3] Jacobs TP， Shohami E， Baze W， et al. Deteriorating stroke model: histopathology， edema， and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits [J]. Stroke，1987，18(4):741-750.

　　[4] Rexed B. A cytoarchitectonic atlas of the spinal cord in the cat [J]. J Comp Neurol，1954，100(2):297-379.

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　　[6] Sirén AL， Fratelli M， Brines M， et al. Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(7):4044-4049.

　　[7] Cheung JY， Miller BA. Molecular mechanisms of erythropoietin signaling [J]. Nephron，2001，87(3):215-222.

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　　[11] Wen TC， Sadamoto Y， Tanaka J， et al. Erythropoietin protects neurons against chemical hypoxia and cerebral ischemic injury by up-regulating Bcl-xL expression [J]. J Neurosci Res，2002，67(6):795-803.

　　[12] Ng T， Marx G， Littlewood T， et al. Recombinant erythropoietin in clinical practice [J]. Postgrad Med J，2003，79(933):367-376.

　　[13] Erbayraktar S， Grasso G， Sfacteria A， et al. Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(11):6741-6746.