甲基强的松龙对成骨细胞钙通道电流的影响

　　作者：贾丙申，陈燕平，高云，张文杰， 薛延 作者单位：1.海南医学院附属医院骨科，海南 海口 570102;2.中国中医科学院望京医院，北京 100102;3.吉林大学生理学教研室，吉林 长春 130021;4.北京积水潭医院骨科研究所，北京 100035

　　【摘要】目的：观察甲基强的松龙(mPSL)对MC3T3E1成骨细胞L钙通道电流(Ltype voltagesensitive calcium channels current，LVSCCsC)的影响。方法:设A组(正常对照组)、B组(106mol/L)、C组(105mol/L)和D组(104mol/L)，各浓度的mPSL作用24h后，膜片钳技术记录每组细胞的LVSCCsC(nA)。结果：正常对照组峰值电流为(-0.2284±0.0209，nA);106mol/L 组为(-0.1991±0.0158, nA)下降12.8%; 105mol/L和104mol/L组分别为(-0.1839±0.0179，nA)、(-0.1610±0.0033，nA)分别下降19.5%和29.5%,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。 结论：mPSL剂量依赖性抑制成骨细胞LVSCCsC。

　　【关键词】 膜片钳技术;钙通道电流;甲基强的松龙;成骨细胞

　　The effect of methylprednisolone on the Ca2+ channel electric currents in osteoblasts

　　JIA Bingshen, CHEN Yanping, GAO Yun, ZHANG Wenjie, XUE Yan

　　(1.Department of Orthopaedics Hainan, Hainan Medical University 570102; 2. Wangjing Hospital of China Academy of Traditional Medicine Science Beijing 100102; 3. Department of Physiology,Jilin University Changchun 130021; 4. Orthopaedics Institution, Jishuitan Hospital Beijing 100035, China)

　　[ABSTRACT] Objective: To observe the influence of methylprednisolone on the Ca2+ channel currents in osteoblasts. Methods： All were divided into four groups,A(control), B(106mol/L)、C(105mol/L) and D(104mol/L).The whole cell patch clamp technique was used in every MC3T3E1 osteoblast of each group to test Ltype voltagesensitive calcium channels current(LVSCCsC). Results: The mean peak current of control group was (-0.2284±0.0209, nA ),B group was (-0.1991±0.0158, nA ) with 12.8% decrease;C and D groups were (-0.1839±0.0179, nA) and( -0.1610±0.0033，nA ) with 19.5% and 29.5% decrease, respectively. There was significant difference as compared with control (P<0.01). Conclusion： Methylprednisolone can inhibit the currents of Lcalcium channels dosedependently.

　　[KEY WORDS] Patch clamp technique; Ca2+ channel; Methylprednisolone; Osteoblast

　　甲基强的松龙(methylprednisolone，mPSL)是一种人工合成糖皮质激素，具有强力抗炎作用、免疫抑制作用及抗过敏作用[1],其对成骨细胞呈双向作用，生理浓度促进成骨细胞分化;超生理浓度长期使用可抑制成骨细胞分化、增殖,使成熟的、具有功能的成骨细胞数目减少[2]。大量研究表明兴奋性细胞的钙通道电流与细胞功能有着密切的联系,但是成骨细胞钙通道电流的研究鲜见报道。本实验运用膜片钳技术观察mPSL对成骨细胞LVSCCsC的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验细胞

　　成骨细胞(MC3T3E1细胞株，购于协和细胞中心)传代培养。原代成骨细胞用0.125%的胰蛋白酶，37℃水浴消化5min，收集细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，传于培养皿中，用含20%胎牛血清的IMDM培养，置于CO2孵箱。实验温度(22±2)℃。培养48h后备用，每株传2～4代。实验时用浴液完全置换培养基。

　　1.2 mPSL的配制和组别设计

　　mPSL(批号H20040338，Pharmacia NV/SA生产，40mg/瓶)，溶解后，取12.5μL原液，加入细胞浴液112.5μL，标记A液;取12.5μL原液，加细胞浴液1237.5μL，标记B液;取12.5μL原液加细胞浴液12487.5μL，标记C液。从备用液体A、B和C中分别取12.5μL，置于终末液体体积为1mL的培养皿中，mPSL的浓度为104mol/L、105mol/L和106mol/L。传代后的细胞分为4组，正常对照组、104mol/L组、105mol/L组和106mol/L组，每组记录10个成骨细胞钙离子电流。除正常组外，各组依次(每个皿)给予A、B和C液12.5μL，作用24h后进行膜片钳实验。

　　1.3 钙通道记录细胞浴液及电极液(单位均为mmol/L)[3]

　　细胞浴液：NmethylDglucamine(NMDG+) 110， BaCl2·2H2O20，HEPES10，glucose10，pH=7.4 (NMDG+缓冲)。电极液：NMDG+100，HEPES150， EGTA20，CaCl2·2H2O， MgCl2·6H2O，pH=7.4(KCl缓冲)。

　　1.4 全细胞记录模式纪录Ca2+离子电流

　　电极由硬质玻璃毛胚(内径1.6mm，壁厚0.2mm)经二次拉制而成，充以电极内液后阻抗1～4MΩ。用微电极操纵器将电极缓慢推向细胞，负压吸引形成高阻封接后吸破电极尖端上的细胞膜形成全细胞记录模式，然后补偿膜极电容和串联电阻。电压钳制脉冲和数据采集由Pclamp软件(美国Axon Instrument，6.02)控制，刺激信号经D/A转换器(1200 A/D、D/A，AXON.INC，美国)和膜片钳放大器(Axonpatch200B,美国)，在电极内形成钳制电压。电流信号经膜片钳放大器输入到模/数(A/D)转换卡，变成数字化信号输入计算机，其数字化频率为1kHz，低通滤波器滤波频率为1kHz。参考文献[2]的方法,记录ICa的保持电位为-70m V，阶跃命令为+10mV，脉宽400ms，从-50mV开始，阶跃至+60 m V。

　　在全细胞电流记录过程中，选用30～50μM的细胞，细胞破膜后的封接电阻大于100MΩ以上，记录观察电流10min，未见明显衰减，用于实验的记录。实验温度为(22±2)℃。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，均值比较采用单因素方差分析(SPSS 11.5软件包),检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 MG3T3E1细胞钙电流的特性分析

　　在正常对照组，钙通道大约在-20mV时开放，最大峰值电流在+20～+30mV(0.2284±0.0209，nA)，反转电位在+60～+70mV( 图1a，图1b)。当在浴液中加入Co2+(50nmol/L)，可阻断此电流的大部分电流成分，其峰值电流为(0.1050±0.0097，nA)(图1b)。而Bayk 8644 增加了此电流(0.3335±0.0323,nA)(图1c)，表明在MG3T3E1细胞上存在对Co2+ 敏感的L型钙通道电流。这与文献报道相符[4]。

　　2.2 不同剂量sPSL对MG3T3E1细胞钙电流影响

　　应用同样的实验方法,在实验24h前加入mPSL 106mol/L 、105mol/L和104mol/L。记录MG3T3E1细胞上的钙电流，在+20mV时，其峰值电流分别为(0.1991±0.0158,nA)、(0.1839±0.0179,nA)和(0.1610±0.0033,nA)(图2)。经单因素方差分析F=19.9, P<0.01，结果见表1。表1 mPSL(106、105、104 mol/L)对钙离子通道电流的影响(略)注：与对照组相比,△P<0.01,与105mol/L mPSL组相比*P<0.05。 抑制率(%)为相对于对照组的抑制百分率。

　　结果显示，mPSL剂量依赖性抑制MC3T3E1成骨细胞的LVSCCsC。

　　3 讨论

　　骨重建是一个复杂的生理生化过程,这一过程主要由成骨细胞和破骨细胞参与。骨形成分为成骨细胞增殖，细胞外基质成熟和矿化，成骨细胞凋亡等4个阶段，成骨细胞来源于多能的骨髓基质的间充质细胞，当其分化成熟后，就分泌各种骨细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein，ECMP)并控制骨基质的矿化过程，同时调控破骨细胞的活动，其增殖与分泌活性很大程度上决定了骨的生长发育和最终骨量。因此，成骨细胞在骨形成作用中起主导作用。多种全身激素(包括糖皮质激素)和骨组织局部调节因子都对此过程发挥作用并最终影响骨形成。

　　钙离子通道又称钙离子通道蛋白,是一种存在于细胞膜上参与转运钙离子的特定蛋白质, 普遍存在于各种细胞上。国内外研究表明，MC3T3E1细胞上存在L钙离子通道，并且此通道参与成骨细胞功能调节[5]。静息状态下，细胞质维持着低钙的状态，当细胞膜受到信号(膜电位的改变或特定的化学物质)刺激时，钙离子通道蛋白构象变化表现为通道的开放状态或关闭状态。在开放状态下，钙离子可以由胞外进入胞内(Ca2+ influx)，产生钙离子电流;反之，关闭状态下，钙离子是不能通过此通道进入细胞内。

　　钙离子作为第二信使，其内流可以直接或间接地影响胞内多种蛋白激酶活性和表达。这些蛋白激酶有：蛋白激酶A(PKA)，钙调蛋白激酶(CaMK)，促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)[69] 。

　　本实验观察到，mPSL使成骨细胞LVSCCsC峰值下降。与对照组相比，从106mol/L到104mol/L， LVSCCsC峰值依次下降了12.8%(P>0.05)、19.5%( P<0.01)和29.5%( P<0.01)，(表1，图2、3)。可见mPSL对LVSCCsC有剂量依赖性抑制作用。此抑制作用与1，25(OH)2D3能激活LVSCCs 的作用[10]是相反的，这可能与激素导致的骨代谢失常有内在的联系。钙离子通道的变化导致Ca2+内流(Ca2+ influx)的变化直接影响到成骨细胞基因的表达和成骨细胞功能的实现。糖皮质激素[11，12]可破坏骨形成和骨吸收平衡，抑制成骨细胞增殖和分裂，增加成骨细胞凋亡，减少成骨细胞数量和降低其功能，导致骨丢失[13，14],减少矿化结节形成和下调成骨细胞的基因表达，如Cbfa1, α1(I) collagen, ALP, 和 OC[15]。

　　在本实验条件下，超生理浓度的糖皮质激素通过抑制成骨细胞LVSCCsC，大幅减少Ca2+内流，而Ca2+内流的减少通过直接或间接的信号转导途径破坏了成骨细胞和破骨细胞数量上和功能上的动态平衡关系,从而引起骨代谢失常, 至于哪些信号转导途径起作用,有待进一步探讨。本研究为糖皮质激素导致骨破坏提供了实验依据，同时也为临床上治疗激素性骨代谢病提供了应用钙离子相关制剂的思路。

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