骨髓间充质干细胞经慢病毒转染绿色荧光蛋白后的体内观察

　　作者：樊守刚，吴小涛，王运涛，李果 作者单位：(东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的:观察经慢病毒转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植注入兔椎间盘后的荧光时效性。方法:体外培养并纯化BMSCs，并用含有GFP标记的重组慢病毒载体(LentivirusGFP)转染后移植入兔椎间盘，在移植后2、4、6、8、10、12周用激光共聚焦显微镜观察BMSCs荧光强度及细胞增殖情况，考察慢病毒转染GFP体内荧光维持时间。结果:经慢病毒转染GFP后的BMSCs，荧光显微镜下48 h开始显现绿色荧光，72 h荧光亮度达到最高。植入体内后8周内均能用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光,8周后荧光强度开始逐渐减弱，第2、4、6、8、10、12周6个时间点GFPBMSCs的阳性率分别是(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%。结论:BMSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖，用慢病毒转染GFP的方法能在至少8周内可靠示踪其在椎间盘内的存活状态，8周后荧光强度开始逐渐减弱。

　　【关键词】 椎间盘退变; 骨髓间充质干细胞; 慢病毒; 绿色荧光蛋白

　　Tracing of bone marrow mesenchymal stem cells with green fluore

　　scence protein labelled in rabbit intervertebral disc

　　FAN Shougang, WU Xiaotao, WANG Yuntao, LI Guo(Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China )

　　[Abstract] Objective: To observe the fluorescence timeliness of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transfected green fluorescent protein(GFP) in the rabbit intervertebral disc after transplanted. Methods: BMSCs were cultured and purified, and transfected with GFPcontained recombinant lentiviral vector(LentivirusGFP) in vitro. The fluorescence intensity of BMSCs and cell proliferation were studied after transplanted into the rabbit intervertebral disc in vivo by confocal laser significantly microscope. Results: Green fluorescence of GFP in BMSCs was collected 48 hours after transfected with GFP, and got the highest fluorescent light at 72hour. In vivo green fluorescence could be obtained by confocal laser microscope within 8 weeks after implantation, and the fluorescence intensity began to weaken after 8 weeks. The positive rates of GFPBMSCs at 2,4,6,8,10,12 weeks were(21.75±1.32)%,(33.07±3.53)%,(33.20±3.60)%,(29.90±4.23)%,(19.64±2.93)% and(10.91±3.43)%. Conclusion: The stabile proliferation of BMSCs can be obtained in the intervertebral disc microenvironment,and can be reliably traced by GFPlentiviral transfection at least within 8 weeks,after which the fluorescence intensity began to step down.

　　[Key words] intervertebral disc degeneration; bone marrow mesenchymal stem cells; Lentivirus; green fluorescence protein

　　椎间盘退变是引起下腰痛的常见病因之一，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植是近年生物治疗椎间盘退变的研究热点，其在小动物实验中已取得肯定疗效[1]，但尚未在大动物实验及临床试验水平有成功报道，在这一技术应用于临床之前，细胞移植本身的排异、BMSCs移植后的去向、存活与分化状态、细胞对髓核内环境的影响以及BMSCs与髓核细胞(nucleus pulposus，NPs)间的相互作用等众多问题尚有待研究，而研究这些问题的基础就是BMSCs移植后的示踪问题。绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)标记技术是一种较为成熟的示踪技术，它具有稳定、安全无毒的优点[2]。本实验用新西兰大白兔作为实验对象，用慢病毒携带GFP转染BMSCs，观察BMSCs在植入兔椎间盘后细胞荧光强度变化与维持时间，同时观察移植后BMSCs与NPs的细胞数目变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　新西兰大白兔(南京农科院种兔厂)，胎牛血清(杭州四季青公司)，慢病毒LentivirusGFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)，倒置荧光相差显微镜(德国Zeiss公司)，流式细胞仪(FACS Vantage，BD公司)，恒温箱冷冻切片机(MICIROM325，德国)，4，6联脒2苯基吲哚(DAPI)染色液试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5，德国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔BMSCs的分离培养方法 取4周龄新西兰大白兔，雌雄不限，用0.5%戊巴比妥钠5 ml·kg-1全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位(双侧髂骨及胫骨)施以局麻。无菌操作下于双侧胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使其通达髓腔。采用密度梯度离心法[3]分离培养BMSCs。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。8～12 d细胞长满瓶底90%以上，以0.25%胰蛋白酶消化，按1传2比例分瓶接种传代培养。此为传1代，传至第3代，备用。

　　1.2.2 用绿色荧光蛋白标记的腺病毒转染BMSCs 取第3代兔BMSCs，待细胞长满瓶底至60%～70%时，更换含有LentivirusGFP重组慢病毒载体的维持液(含2%胎牛血清)，维持液中含感染复数(MOI)为50的LentivirusGFP慢病毒108颗粒·ml-1，24 h后更换含10%胎牛血清的正常培养液继续培养。使用流式细胞仪分选GFP阳性细胞，分选后备用。

　　1.2.3 BMSCs移植手术方法 纯种成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，平均体重2.5 kg，每只兔移植L3～4、L4～5节段椎间盘。采用后侧方手术入路[4]，兔右侧卧位，沿左侧第12肋末向下至髂嵴作纵切口，在骶棘肌和腰方肌的外缘与胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘可触及横突，剪开胸腰筋膜前层可见腰大肌，用神经剥离子纵行分开，即可显露椎体和椎间盘。用21号注射针头穿刺确认椎间盘，抽吸出髓核组织，并立即用微量注射器注射植入含GFPBMSCs的PBS溶液(浓度为5×106个细胞·ml-1)25 μl。注射后逐层缝合，继续饲养。

　　1.2.4 冰冻切片制作 在移植术后2、4、6、8、10、12周各用Excel随机函数法取4只兔，采用耳缘静脉注射空气10 ml处死，取各相应节段椎间盘，标本经OCT包埋后于液氮罐(-190 ℃)中冰冻保存，用恒温箱冷冻切片机制作6 μm冰冻切片。每个椎间盘标本分别取不通层次3张切片立即行HE染色，光镜下(×40)进行细胞计数。

　　1.2.5 激光共聚焦显微镜检测GFPBMSCs阳性率 激光共聚焦显微镜下计数细胞：按4，6联脒2苯基吲哚(DAPI)染色液试剂盒说明书步骤进行冰冻切片染色，每张切片在200倍视野下找5个视野观测，分别计数蓝绿共染细胞和蓝染细胞。激光共聚焦显微镜观测时波长设置如下：观察DAPI核染细胞激发波长405 nm，发射波长454 nm;观察GFP阳性细胞激发波长509 nm，发射波长505 nm，采用Leica TCS SP5系统工具融合图像。分别计数移植后2、4、6、8、10、12周6个时间点BMSCs(蓝绿共染细胞)和NPs(蓝染细胞)，计算GFPBMSCs阳性率。观察移植术后第2、4、6、8、10、12周GFP荧光的强弱和示踪持续时间。

　　1.3 统计学处理

　　实验所得数据用±s表示，不同时间点数据间的比较采用单因素方差分析,采用SPSS 11.5统计学软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 BMSCs生长及形态观察

　　原代BMSCs接种后24 h细胞开始贴壁生长，细胞多呈圆形或类圆形，随培养天数的增加，贴壁细胞不断增殖，周围的细胞逐渐生长为多角形或梭形，最后变为长梭形(图1)。台盼蓝排斥试验可见原代培养中贴壁的BMSCs活力良好，细胞活性在95%以上，着色细胞极少，传代后BMSCs仍能保持良好的活力，细胞活性不低于90%。图1 光镜下原代BMSCs形态(×40)

　　Fig 1 BMSCs observed by microscope(×40)2.2 GFP转染标记BMSCs

　　BMSCs在LentivirusGFP转染后细胞形态规则，生长仍然旺盛，随培养时间延长多角形细胞增多，未见显著细胞形态改变，部分细胞胞浆可见较多分泌性颗粒，细胞分裂增殖基本正常，与未感染的BMSCs相比，三角形、多角形细胞所占比例增多。转染后48 h细胞发出微弱的绿色荧光，发光细胞数量较少，72 h绿色荧光明显强于48 h，而且发光细胞数量较多，并且随着传代能稳定显现较强荧光。流式细胞仪筛选后细胞GFP阳性率达到95%。

　　2.3 冰冻切片HE染色细胞计数

　　HE染色后，髓核组织内细胞呈规则聚集分布，细胞核蓝染，细胞浆红染，髓核组织基质内呈无色，第2、4、6、8、10、12周分别计数总细胞数目为(107.17±7.94)、(110.80±8.41)、(106.50±11.15)、(104.67±10.15)、(105.33±7.45)和(106.50±9.14)个·视野-1。各时间点间差别无统计学意义(P>0.05)。

　　2.4 激光共聚焦显微镜检测GFPBMSCs阳性率

　　激光共聚焦显微镜下GFPBMSCs在8周内均能呈现较强的绿色荧光，10周时荧光强度较8周时有所减弱，12周时仅观察到极微弱的荧光。第2、4、6、8、10、12周GFPBMSCs阳性率(蓝绿共染细胞占蓝染细胞比例)分别为(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%。GFPBMSCs阳性率2周时低于4、6、8周(P<0.05)，4、6、8周差异无统计学意义(P>0.05)，10周时GFPBMSCs阳性率比8周降低，差异有统计学意义(P<0.05)，12周时GFPBMSCs阳性率比10周时明显降低(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　GFP基因产物经翻译后加工，可产生荧光而不需添加任何底物。生色基团的形成无种属特异性，且对细胞是无毒的。它的表达也不影响细胞的生长和功能，因而能方便可靠地用于转基因表达的检测[5]。本实验选择用慢病毒转染GFP示踪BMSCs，在转染后荧光被荧光显微镜捕捉，细胞移植入体内后能在8周内清楚显现绿色荧光，提示细胞保持良好的存活状态。

　　慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，而并非是染色体质粒上，从而达到持久性表达，可有效地感染肝细胞等多种类型的细胞[6]。本实验通过LentivirusGFP转染BMSCs，细胞72 h后能稳定显现绿色荧光，移植入兔椎间盘后，8周内能稳定显色，为今后BMSCs移植治疗椎间盘退变的研究提供新的有效示踪方法。

　　HE染色细胞总计数2周时较低，4～12周时数目增多，但差异无统计学意义，提示BMSCs移植早期有部分细胞死亡，4周后存活细胞稳定分裂增殖，适应了椎间盘髓核的内环境，虽然8周后荧光强度逐渐减弱，而总细胞计数未有明显减少，提示细胞仍然存活，但荧光表达量逐渐降低。

　　椎间盘退变是人体随着年龄的增长，椎间盘内髓核组织的营养供应不足，髓核退变后脱出，压迫周围组织，从而引起临床上椎间盘突出、椎管狭窄、退变性脊柱滑脱等疾病[7]。目前椎间盘退变的治疗主要是通过药物、手术切除突出的椎间盘[8]、脊柱融合固定等措施来缓解症状，尚无针对原因的有效治疗。近年来发展的基因治疗、细胞或髓核移植及组织工程等生物学治疗方法，通过人工干预早期阻止或逆转椎间盘退变，恢复其生物学功能，是将来理想的治疗方法[9]。国内外学者的研究表明BMSCs移植修复退变椎间盘是一种可行的生物治疗方法[10]。本实验通过GFP标记BMSCs，用DAPI标记所有的有核细胞，通过荧光观察到至少8周内BMSCs和NPs的细胞比例平均值维持在1∶2.45，提示移植后BMSCs在髓核内环境占有较大的比例，具有较大的作用空间。然而BMSCs经移植后是通过分化作用或细胞间相互作用等来改变髓核内环境，以及细胞作用的具体分子机制等，本实验尚不能得出直接结论。

　　【参考文献】

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　　[4] 赵梓汝,吴小涛,祁亚斌,等.TGFβ1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2006,14(13):10191022.

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　　[6] KUBO S, KATAOKA M, TATENO C，et al. In vivo stable transduction of humanized liver tissue in chimeric mice via highcapacity adenovirus Lentivirus hybrid vector[J]. Hum Gene Ther， 2006,3(8):383384.

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　　[8] 陈辉,吴小涛，茅祖斌，等.后路脊柱内窥镜下髓核摘除术治疗椎间盘钙化的腰椎间盘突出症[J].现代医学,2002,30(6)：370372.

　　[9] RICHARDSON S M, MOBASHERI A, FREEMONT A J，et al. Intervertebral disc biology, degeneration and novel tissue engineering and regenerative medicine therapies[J]. Histol Histopathol， 2007，22(9):10331041.

　　[10] SAKAI D, MOCHIDA J, YAMAMOTO Y, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration[J]. Biomaterials, 2003,24(20):35313541.