应用低浓度长春新碱分离并鉴定MG63细胞系中的骨肉瘤干细胞

　　作者：娄楠 王岩　赵建武 高忠礼 作者单位：(吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033 )

　　【摘要】 目的 分离并鉴定人成骨肉瘤细胞系MG63中的骨肉瘤类肿瘤干细胞。方法 通过无血清培养基加入低浓度长春新碱的方法悬浮培养成骨肉瘤细胞球来进行分离和类干细胞富集。后行细胞形态学观察、细胞球免疫荧光染色、RTPCR、流式细胞仪鉴定细胞表面标志物，成骨、成脂肪诱导及裸鼠成瘤的一系列鉴定试验。结果 悬浮培养得到肉瘤细胞球，可持续传代细胞亚系“MG63M”，多能干细胞、胚胎干细胞标志物及多药耐药基因表达均为阳性。具有很强的自我更新及多项分化能力。结论 MG63细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的骨肉瘤干细胞，而采用神经干细胞培养基中添加低浓度长春新碱是从骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞的有效办法。

　　【关键词】 MG63细胞;单克隆;细胞株

　　肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分细胞，像正常干细胞一样，具有自我更新能力。这种为数不多的细胞呈不对称分裂，产生的绝大多数细胞是普通肿瘤细胞，而真正致瘤和维持肿瘤持续增长的类干细胞的数量是非常稀少的。根据此理论，推断骨肉瘤干细胞的存在也许正是骨肉瘤的异质性和对化疗药物的抗药性存在的关键。而Gibbs〔1〕等已经利用神经干细胞培养液悬浮成球的方法成功的分离出 骨肉瘤干细胞，也证明其表达胚胎干细胞的关键标志物，具有自我更新和多项分化能力。本研究利用肿瘤干细胞具有化疗药物抵抗的特点，使用神经干细胞培养基加入低浓度长春新碱悬浮成球的方法，进一步富集骨肉瘤肿瘤干细胞。而得到的细胞亚群同样具有自我更新和多项分化能力、更高的致瘤能力和极为显著的化疗药物耐药性。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 人成骨肉瘤细胞MG63购自ATCC。高糖DMEM (Gibco，USA)，优等胎牛血清(Hyclone，USA) ，胰酶 (Promega，USA)，二甲基亚砜(DMSO，天佳生物科技有限公司中国)，Trizol、TaKaRa RTPCR Kit(TaKaRa，Japan)，CCK8(碧云天生物 研究所) ，TritonX100、PI、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、 噻唑蓝 (MTT)和表皮生长因子(EGF)(Sigma，USA)，鼠抗人CD44FITC、CD45FITC、CD106FITC、CD133FITC、CD105FITC(武汉博士德公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司),PCR引物(上海生物工程公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 悬浮成球试验 MG63细胞以6×104的密度接种在6孔板(Corning，Inc.，Corning,NY)，使用含有1%甲基纤维素的无血清HDMEM培养基，其中加入黄体酮(20 nmol/L)、转铁蛋白(25 mg/ml)、长春新碱(10 ng/ml)、胰岛素(20 mg/ml)，hEGF(10 ng/ml)，bFGF(10 ng/ml)每2 d加入1次，培养6 d和12 d，使用相差显微镜进行观察计数。培养5～7 d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后，吸取培养基并离心，用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液，按 1∶2或 1∶3比例传代。使用重复3次。

　　1.2.2 RTPCR检测类肿瘤干细胞中OCT4、Nanog、nestin、mdr1 mRNA的表达 选取生长状态良好的MG63和MG63M细胞各2×1010个细胞 /ml,按 Trizol提取试剂盒说明提取细胞内RNA。PCR扩增产物行 1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色观察，电泳产物用FT500凝胶成像系统照相，各系统经吸光度扫描仪进行分析。

　　1.2.3 流式细胞仪测定细胞表面标志物 收集对数生长期的各组细胞5×105，1 000 r/min离心5 min。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗1次。0.1% Triton X100 0.5 ml，10 min。PBS清洗1次。一抗(兔抗人MMP26多克隆抗体1∶1 000稀释)4℃孵育40 min，PBS清洗1次。二抗(羊抗兔FITC标记)4℃孵育40 min。PBS清洗1次，500 μl PBS重悬，流式细胞仪检测。

　　1.2.4 CCK8法检测类肿瘤干细胞增殖活性 生长曲线测定:细胞接种，胰酶消化80%融合状态的细胞，细胞计数以1×104接种7块96孔板，每种细胞设8个平行孔。每日定时随机取出一块孔板，每加入含10%胎牛血清的HDMEM 90 μl/孔，并加入10 ul/孔CCK8，37℃孵育3 h后测量光吸收值。统计数据、分析结果并作图。全自动荧光酶标仪在 490 nm波长下测定吸光度值 (D值)，取均值并绘制生长曲线。

　　1.2.5 免疫荧光染色 将盖片放入无水乙醇:冰醋酸=1∶1的液体中浸泡30 min;弃去浸泡液，纯水冲洗;再用无水乙醇浸泡30 min，然后用绸布擦干;将处理的盖片置于小平皿内高压、烤干备用。取P6代细胞，用0.25%胰酶37℃消化3 min左右，加入含10%FCS培养液中和胰酶，轻轻吹打细胞，吸取细胞悬液离心，800 r/min，6 min，使细胞形成微团，再用培养液重悬细胞;计数细胞，以104～105个细胞/ml接种在预先已放置盖片的24孔板内;当细胞长满盖片的80%左右，将培养液吸出，37℃预热的0.1 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;4%多聚甲醛室温固定30 min;0.1 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;蒸馏水冲洗3次，5 min/次;将细胞爬片在37℃孵箱中烘烤2 h，然后放入-20℃冰箱保存，以备染色。将爬片从24孔板内取出，蒸馏水水化10 min后，应用0.1%TritonX100渗透打孔10 min，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5min/次;滴加阻断剂室温孵育15 min;0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;滴加封闭血清，室温孵育30 min;甩掉盖片上的多余血清，滴加一抗(浓度为1∶50)，37℃孵育1 h或4℃过夜，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;滴加FITC标记二抗，同时加入罗丹明或DAPI染细胞核，放置于湿盒内，常温避光反应30 min，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;激光扫描共焦显微镜(LSCM)下观察。

　　1.2.6 成骨诱导体系的建立 将MG63、MG63M两个细胞系细胞，以3×103个细胞/cm2的密度接种于100 mm平皿内，加入含10%FBS的无酚红LDMEM培养基培养48 h后，换为成骨基础诱导液，分为MG63对照组、MG63M组;每4 d换1次培养液，雌激素和抑制剂每2 d添加1次，诱导24 d。行von cossa染色。

　　1.2.7 成脂肪诱导体系建立 将MG63、MG63M两种细胞系细胞，以4×103个细胞/cm2的密度接种于100 mm平皿内，加入含10%FBS的无酚红LDMEM培养基培养24 h后换为成脂肪诱导液(胰岛素0.01 mg/ml、0.2 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、0.2 μmol/L地塞米松，10%FBS无酚红LDMEM培养基)，每4 d换1次培养液，雌激素和抑制剂每2 d添加1次，诱导12 d。行油红O染色鉴定脂滴。

　　1.3 统计学处理 应用 SPSS11.5统计软件进行数据处理。计量资料采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 细胞球的形成 MG63骨肉瘤细胞离心后置于无血清培养基中，培养48～72 h后形成大小不等的只有数个细胞的圆形类细胞球，悬浮生长，而不能形成细胞球的贴壁细胞因无法耐药基本死亡。细胞球传代后 2 d即可见到次代肿瘤细胞球的形成，以后体积逐渐增大，形态规则。细胞球可传代，命名为“M”细胞株。见图1。

　　2.2 RTPCR结果 多能干细胞标志物(CD133)，胚胎干细胞标志物(OCT3/4、 nestin、nanog)，多药耐药基因(MDR1、ABCG2)均在“M”细胞中呈现高表达。

　　2.3 流式细胞仪测定细胞表面标志物 流式细胞仪检测间充质干细胞标志物(CD105，CD90，CD44，CD29)，造血干细胞标志物(CD34，CD133)，上皮干细胞标志物(CD24)。结果证明CD34、CD31、CD105无论在MG63还是M细胞株都呈阴性表达，而CD90和CD44都呈较强的阳性，且表达量基本相当。而M细胞株CD29表达量略高，CD24略低于MG63;多能干细胞标志物CD133在M细胞中的表达远远高于MG63，而这在RTPCR 的检测中也得到了验证。

　　2.4 类肿瘤干细胞增殖活性 类肿瘤干细胞的增殖潜伏期约为 22.8 h,传代后 24～48 h即可见传代的肿瘤干细胞形成，以后细胞数量逐渐增多。类肿瘤干细胞对数倍增时间约为传代后3～5 d。

　　2.5 免疫荧光染色 无血清悬浮培养中的悬浮肉瘤细胞球行免疫荧光染色，发现多能干细胞标志物(CD133)、胚胎干细胞标志物(OCT3/4、 nestin、nanog)、多药耐药基因(MDR1、ABCG2)均呈阳性表达。PI染细胞核。见图2。

　　2.6 成骨、成脂肪诱导 分别使用成骨及成脂诱导液对“M”细胞进行诱导，成脂诱导14 d胞浆内可见大量脂滴形成。成骨诱导24 d可见骨结节形成。见图3。

　　3 讨 论

　　本实验中再次确定骨肉瘤中确实存在一个具有悬浮成球和自我更新能力的细胞亚群，而这也与从脑肿瘤和乳腺肿瘤中分离出的肿瘤干细胞在大体形态上相同〔1，2〕。通过这种悬浮成球的方式得到的干细胞样肿瘤细胞的很多性质与正常干细胞和脑胶质瘤干细胞也极为相似。此外，这些干细胞样的肿瘤细胞表达很多间充质干细胞的标志物，如CD44、CD45、CD105 等，而其也具备间充质干细胞的至少两项分化能力。此外，这些细胞表达内、中、外三个胚层的相关基因，而肿瘤细胞球高表达胚胎干细胞多分化潜能的关键性标志物Oct 3/4、nestin和 Nanog。综上所述，这些数据都有力的说明骨肉瘤中确实有类干细胞性质的亚群存在。骨肉瘤细胞球与普通骨肉瘤细胞最显著的差异就是Oct 3/4、nestin和 Nanog的高表达，而进一步深入的研究发现，早期形成的小细胞球中Oct 3/4、nestin和 Nanog的阳性表达极高，随着细胞球增大，细胞数目的增多，胚胎干细胞标志物的表达逐渐降低，也说明了肿瘤呈现了更显著的异质性。而这些都说明原始的干细胞样肿瘤细胞经历了一个对称分裂到不对称分裂的转变，也因此产生了多种成分的子代肿瘤细胞。有趣的是通常认为是间充质恶性肿瘤的骨肉瘤实际上是表达三个胚层的基因,但在体内的骨肉瘤却为间充质性质。而与其一致的是培养中的细胞也显示了间充质干细胞所应有的特征性蛋白。这些都能说明骨肉瘤肿瘤干细胞最有可能由幼稚的间充质干细胞发展而来。骨肉瘤是由成骨细胞转变而来，多发生在年轻成人。尽管肿瘤发生来源不同，但其中的干细胞样成分和其表达情况却是没有差别的。相信此类肿瘤中的肿瘤干细胞维持肿瘤生长的机制也是相差无几的。

　　Oct 3/4是Pou家族的同源异型蛋白(质)，最初在胚胎内细胞中表达，是胚胎干细胞保持多项分化能力的根本，其随着胚胎的生长发育而逐渐下调〔3〕。而在成体中，Oct 3/4只在A型精原细胞、睾丸生殖干细胞瘤、畸胎瘤和某些始祖干细胞中有所表达〔4〕。体细胞中并为发现〔5，6〕。

　　近年发现的一种同源域蛋白Nanog，被认为处于维持ES细胞自我更新的细胞外刺激、细胞内多种因子共同参与的复杂的网络调节系统的中心环节。Oct4直接作用于Nanog，以维持它在一个亚稳定状态的浓度，而不会让它达到或超过稳定状态的水平;原本在体细胞中不表达的Nanog 基因变得高表达，提示Nanog基因的重新激活在细胞扩增和维持细胞全能性中扮演了重要角色〔7〕。而Nanog和Oct 3/4一样并未在成体细胞中发现过。总而言之，Oct 3/4、Nanog和nestin是负责鼠类胚胎干细胞的多项分化潜能和自我更新状态的关键蛋白〔8〕。如果他们在肿瘤干细胞中扮演了相同的角色，那么这就是骨肉瘤靶向治疗的重要分子生物学靶点。

　　本研究也进一步支持了实体瘤中含有极少数目负责肿瘤发生和增长的肿瘤干细胞这个假设，假设肿瘤干细胞理论是正确的，那么细胞毒性的化疗药物只是根据肿瘤的整体反应来判断药物效果，而并没有对这一小部分的致瘤细胞进行特别标记，而肿瘤干细胞理论也能够解释骨肉瘤对于化疗的相对抵抗(单纯化疗的骨肉瘤患者生存率只有20%)〔7〕。认为Oct 3/4和Nanog两个转运子是这些细胞能够维持干细胞特性的分子生物学的关键所在。

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