单侧黑质纹状体通路损毁改变腹侧苍白球的神经活动

　　作者：张巧俊,杨慧丽,颜虹,蔺雪梅,向莉,刘健　　作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院神经内科，陕西西安 710004;

　　【摘要]目的 观察单侧黑质纹状体通路损毁对大鼠腹侧苍白球(ventral pallidum, VP)神经元电活动的影响。方法 采用在体细胞外记录方法研究正常大鼠和帕金森病(Parkinsons disease, PD)大鼠VP神经元放电频率和放电形式的变化。结果 对照组大鼠VP神经元的平均放电频率为(16.1±1.2)Hz (n=41);2周和4周PD组大鼠VP神经元的平均放电频率分别是(9.3±0.8)Hz (n=43)和(8.6±1.0)Hz (n=47)，与对照组相比，VP神经元的平均放电频率显著减低(P均<0.001)，但两PD模型组之间VP神经元的平均放电频率无明显差异(P>0.05)。在对照组大鼠，规则放电的神经元占44%(18/41)，不规则放电的神经元占52%(21/41)，爆发式放电的神经元仅占4%(2/41);在2周和4周PD模型组大鼠，具有规则、不规则和爆发式放电的VP神经元的百分比分别为14%(6/43)、47%(20/43)、39%(17/43)和17%(8/47)、49%(23/47)、34%(16/47)，2周和4周PD组大鼠VP中爆发式放电的神经元明显多于对照组(P均<0.01)，而两PD模型组之间VP神经元的放电形式未见显著性差异(P>0.05)。结论 单侧黑质纹状体通路损毁诱发大鼠VP神经元的放电频率降低，具有爆发式放电的神经元增多，这种变化可能与伏核VP的抑制性神经传递增强有关。

　　【关键词】 腹侧苍白球,帕金森病,电生理学,大鼠

　　ABSTRACT: Objective To investigate the changes in neuronal activity of the rat ventral pallidum (VP) following unilateral lesion of the nigroatriatal pathway. Methods The changes in the firing frequency and firing pattern of VP neurons were examined with extracellular recording methods in control and Parkinsons disease (PD) rats. Results The results showed that the mean firing frequency of VP neurons in control rats was (16.1±1.2)Hz (n=41). In PD rats, the mean firing frequency of VP neurons after unilateral lesion of the nigroatriatal pathway at week 2 and 4 was (9.3±0.8)Hz (n=43) and (8.6±1.0)Hz (n=47), respectively. The mean firing frequency of VP neurons of PD rats at week 2 and 4 was significantly decreased when compared to that of control rats (all P<0.001). However, there was no significant difference in the mean firing frequency of VP neurons of PD rats at week 2 and 4 (P>0.05). Concerning the firing pattern, 44% (18/41) of VP neurons fired regularly, 52% (21/41) exhibited irregularity and 4% fired in bursts in control rats. In PD rats, 14% (6/43) of VP neurons fired regularly, 47% (20/43) irregularly and 39% in bursts at week 2; 17% (8/47) of VP neurons fired regularly, 49% (23/47) irregularly and 34% (16/47) in bursts at week 4, respectively. The percentage of PD rats neuron firing in bursts at week 2 and 4 was significantly higher than that in control rats (all P<0.01), but the difference in PD rats firing pattern between week 2 and 4 did not reach a significant level (P>0.05). Conclusion Unilateral lesion of the nigroatriatal pathway induces a decrease of the firing frequency on VP neurons and an increase of the percentage of the neuron firing in bursts, suggesting that the changes may be associated with the increase of the nucleus accumbensVP inhibitory neurotransmission.

　　KEY WORDS: ventral pallidum; Parkinsons disease; electrophysiology; rat

　　帕金森病(Parkinsons disease, PD)是一种常见的神经系统变性疾病，主要病理改变是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元进行性退变，导致纹状体中多巴胺含量显著降低，进而引起整个基底神经节环路和相关脑区的结构和功能发生改变。本病临床表现以进行性加重的运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势步态异常和表情减少为特征。但是，PD不仅仅是一个运动系统的疾病，研究发现在部分PD患者有抑郁、焦虑和痴呆的表现，并且这些表现可出现在运动系统症状之前[13]。磁共振和尸检发现PD患者边缘系统的杏仁核和海马的体积缩小，反映出这些结构中的神经元减少和路易氏体形成[4]。研究证实腹侧苍白球(ventral pallidum, VP)与基底神经节和边缘系统之间有复杂的纤维联系，VP参与运动功能的调节，并在情感、认知和药物成瘾与奖赏强化等方面发挥作用[5]。然而，黑质纹状体通路的变性如何影响VP神经元的活动目前尚不清楚。因此，本研究以6羟基多巴胺(6hydroxydopamine, 6OHDA)PD模型大鼠为对象，采用玻璃微电极细胞外记录方法，观察PD模型大鼠在SNc多巴胺能神经元损毁后不同时间VP神经元电活动的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 PD大鼠模型的建立

　　实验选用西安交通大学医学院实验动物中心提供的健康雄性SD大鼠34只，体重260～300g。大鼠在标准环境饲养1周，随机分为对照组(n=11)、2周PD组(n=11)和4周PD组(n=12)。PD组大鼠在水合氯醛(300mg/kg, i.p.)麻醉下固定于脑立体定位仪上，根据PaxinosWatson大鼠脑定位图谱确定右侧SNc的位置：AP -4.8～5.3mm;L 1.8～2.3mm;D 7.1～7.3mm[6]。注射6OHDA前30min，先给大鼠注射地西帕明(25mg/kg, i.p.; Sigma)以保护去甲肾上腺素能神经元。6OHDA(Sigma)溶于含0.1mL/L抗坏血酸的生理盐水中，用前配制。10μL微量注射器与玻璃微电极相连，尖端直径约50μm，分两个位点在SNc注射6OHDA，每点4μg/2μL，总量8μg/4μL，给药速度1μL/min，注射完毕后留针5～10min，退针。6OHDA注射后1周，给大鼠注射阿朴吗啡(0.05mg/kg, s.c.)，10min后诱发向健侧旋转每5min大于20转者，表明PD模型成功，列为实验对象[7]。

　　1.2 电生理记录

　　电生理记录在SNc损毁后2周和4周进行。大鼠在乌拉坦(1.2g/kg, i.p.)麻醉下固定于脑立体定位仪上，并确定右侧VP的位置：AP -0.3～0.4mm;L 2.1～2.5mm;D 6.4～7.6mm[6]。采用玻璃微电极细胞外记录法记录VP神经元的放电。电极尖端直径1～2μm，阻抗10～20MΩ，充灌液为0.5mol/L醋酸钠含2%滂胺天蓝。细胞放电经微电极放大器显示于记忆示波器上，以观察电位波形和细胞放电的形式，同时信号输入监听器监听。将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞放电经生物电信号采集与分析系统输入计算机后，做实时观察、储存和进行频率及放电形式的分析，每一神经元的采样时间5～10min。整个实验过程中监测大鼠心电，直肠温度维持在(37±0.5)℃。

　　根据放电间隔图(interspike interval histogram, ISIH)确定神经元的放电形式。每一神经元ISIH的生成最少包含500个动作电位，bin宽4ms。依据该图将神经元的放电形式分为规则、不规则和爆发式放电。规则放电ISIH呈对称分布;不规则放电ISIH呈随机分布;爆发式放电ISIH呈现逐渐衰减的正偏态分布。从ISIH中我们还测量和计算了众数(mode)、不对称指数(asymmetry index, AI)和变异系数(coefficient of variation, CV)，以协助判断神经元放电形式的变化。众数指最高频率的放电间隔(interspike interval, ISI);AI为众数与平均ISI的比值，反映ISIH的形状，该值小于1表示正偏态分布;CV是ISI的标准差与平均ISI的比值，反映神经元活动的规律性[7]。

　　1.3 组织学定位

　　电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝标记记录位点(-20μA, 15min)。大鼠在麻醉下经心脏灌注生理盐水，随后用40g/L多聚甲醛溶液灌注固定，迅速断头取脑，后固定4h。冠状冰冻切片，片厚50μm，确定被记录神经元的位置。

　　1.4 统计学分析

　　采用SPSS11.0软件对位于VP内的神经元的电活动进行统计分析。实验数据以±s表示。对照组、2周和4周PD组大鼠VP神经元放电频率和放电形式参数的比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，组间两两比较采用LSDt检验，α=0.05，即以P<0.05为差异有统计学意义。3组大鼠放电形式的比较采用χ2检验，检验水准为α=0.0167，以P<0.0167为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　本实验分别记录和分析了对照组大鼠VP中41个神经元、2周PD组大鼠43个神经元和4周PD组大鼠47个神经元的电活动。

　　2.1 腹侧苍白球神经元的平均放电频率

　　对照组大鼠的VP神经元放电频率为1.3～34.9Hz[(16.1±1.2)Hz, n=41];2周和4周PD组大鼠VP神经元放电频率的变化范围分别是1.7～24.9Hz[(9.3±0.8)Hz, n=43]和1.0～26.9Hz[(8.6±1.0)Hz, n=47]。3组大鼠之间的放电频率有显著性差异(F=15.206，P<0.001);2周和4周PD组大鼠VP神经元的放电频率明显低于对照组(P均<0.001)，但两组PD模型大鼠VP神经元的放电频率之间未见明显变化(P>0.05，图1)。

　　2.2 腹侧苍白球神经元的放电形式

　　对照组大鼠的VP神经元表现出3种放电形式，规则放电的神经元占44%(18/41)，不规则放电的神经元占52%(21/41)，爆发式放电的神经元仅占4%(2/41)(图2D)。在2周PD组大鼠，也有3种形式的神经元放电，其规则放电、不规则放电和爆发式放电的神经元分别为14%(6/43)、47%(20/43)和39%(17/43);4周PD组大鼠规则放电、不规则放电和爆发式放电的神经元分别为17%(8/47)、49%(23/47)和34%(16/47)(图2A～2D)。经χ2检验，2周和4周PD组大鼠VP中爆发式放电的神经元明显高于对照组(2周，χ2=17.829，P<0.01;4周，χ2=14.484，P<0.01)。在2周和4周PD组大鼠VP神经元的放电形式无显著性差异(χ2=0.348，P>0.05)。

　　反映3组大鼠VP神经元放电形式的参数ISI、众数、AI和CV也有显著差异。3组大鼠的平均ISI分别是(96±9)ms、(169±20) ms和(281±43)ms，它们之间有显著性差异(F=9.353，P<0.001)，其中4周PD组大鼠的平均ISI显著大于对照组(P<0.01，图3A)，表明VP神经元的放电频率减慢。对照组、2周PD组和4周PD组VP神经元的平均众数分别是(58±5)ms、(70±9)ms和(87±13)ms，3组大鼠的平均众数差异显著(F=15.206，P<0.001)，其中4周组大鼠的平均众数明显大于对照组(P<0.05，图3B)。平均AI在对照组大鼠为0.8±0.1，2周PD组大鼠为0.6±0.1，4周PD组大鼠为0.6±0.1，它们之间有显著性差异(F=4.735，P<0.01);PD组显著小于对照组(P均<0.01，图3C)，且均值小于1，说明ISIH是正偏态分布;CV在3组之间也有显著差别(F=29.867，P<0.001)，对照组大鼠为0.4±0.01，2周PD组大鼠为0.7±0.01，4周PD组大鼠为0.6±0.01，PD组的CV显著大于对照组(P均<0.001，图3D)，反映PD组大鼠VP神经元的活动更加不规则，倾向于爆发式活动。

　　3 讨 论

　　VP是苍白球复合体的一部分，与脑内诸多核团、区域有密切的纤维联系。VP主要接受来自伏核的GABA能纤维投射，伏核壳部纤维投射至VP的内侧部，并选择性投射到腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)和丘脑的背内侧核，而伏核核部纤维投射至VP的外侧部，然后投射到底丘脑核(subthalamic nucleus, STN)[3,5,89]。VP除了主要接受来自伏核的GABA能投射外，其传入纤维还有来自杏仁体的谷氨酸能和GABA能投射，来自前额叶皮质和STN的谷氨酸能投射，以及来自黑质和VTA的多巴胺能投射[1014]。VP的传出纤维投向区域也相当广泛，而且主要是抑制性GABA能传出。VP与脑内基底节和边缘系统之间的广泛而复杂的纤维联系决定了其功能的多样性[15]，它在运动功能的调节、认知、情绪和药物奖赏与成瘾等方面发挥作用[7]。本实验通过对比正常大鼠和2组PD大鼠VP神经元的电活动发现，黑质纹状体通路损毁导致VP神经元的放电频率明显减慢，而且放电形式也有显著的改变，爆发式放电增多而规则放电减少，表明VP神经元在该状态下的电活动受到抑制。这个结果提示除了VP神经元自身活动发生变化外，更为重要的是其兴奋性和抑制性传入之间的平衡发生了显著的改变，即抑制性传入活动增强，而兴奋性传入活动减弱，最终导致VP神经元的电活动受到抑制[9]。

　　VP主要的抑制性传入纤维是来自伏核的GABA能纤维，而伏核的传入纤维又来源于VTA[8,15]。在正常情况下，VTA的多巴胺能投射对伏核神经元的活动起抑制作用[10,13]，而伏核的GABA能纤维投射抑制VP神经元的活动。免疫组化结果表明PD大鼠VTA的多巴胺能神经元减少高达45%～60%，从而导致VTA多巴胺能纤维投射区的多巴胺含量显著降低[14]。因此，我们推测PD时由于VTA内多巴胺能神经元的变性、缺失导致了伏核内多巴胺含量明显降低，使得伏核神经元去抑制或抑制性降低而表现为兴奋性活动增加，活动增强的伏核GABA能神经元抑制VP神经元的活动。

　　VP的兴奋性传入纤维主要来自STN的谷氨酸能纤维投射[3]。许多研究已经证实在PD状态下由于SNc内多巴胺能神经元的缺失，导致纹状体内多巴胺水平显著降低，纹状体GABA能神经元对苍白球外侧部的抑制作用增加，从而使STN去抑制，表现为STN神经元的活动增强。VP接受来自STN的兴奋性谷氨酸能纤维投射，STN兴奋性传出的增强[7]，应该使VP神经元电活动增加。但是，本实验结果显示PD状态下VP神经元放电频率减慢，究其原因可能为VP内神经递质的平衡状态被打破，STN发出的谷氨酸能投射增强引起VP神经元兴奋，而VP神经元的活动取决于兴奋性和抑制性传入活动的总和。因此，黑质纹状体通路变性后VP神经元的电活动减弱，说明来自伏核的抑制性GABA因素在VP神经元的活动中占据优势。神经元放电形式的变化取决于神经元的自身活动和外来传入的影响，爆发式放电活动与神经递质的释放密切有关。SNc多巴胺能神经元的变性导致基底神经节环路的抑制性输出增加，抑制丘脑、皮层等核团和脑区的神经元活动，而在基底神经节环路的间接通路中STN的活动是增强的，这些因素之间的综合作用可能是VP神经元爆发式活动增多的原因。由于中枢神经系统解剖和功能的复杂性，我们的在体实验结果证实黑质纹状体通路的损毁诱发了VP神经元的放电频率显著降低，爆发式放电神经元的数目明显增加，这些变化可能主要与伏核–VP抑制性GABA传递的增强有关。鉴于VP参与体内多种功能的调节，黑质纹状体通路的变性引起VP神经元活动的改变也为PD状态下运动功能障碍和认知、情感功能紊乱的研究提供了新线索。

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