骨髓间充质干细胞的研究进展

作者：马雪峰,朱肖奇   【关键词】  骨髓 干细胞

   骨组织工程学研究内容主要包括三方面a)种子细胞的研究；b)支架材料的研究；c)组织工程化骨的临床应用。其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。作为骨组织工程的理想种子细胞，应具有以下特点：a)结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；b)取材容易，对机体损伤小；c)体外培养增殖能力强；d)可在一定条件下向特定方向转化；e)稳定表达成骨细胞表型；f)植入人体后能继续产生成骨活性；g)无致瘤性［1～2］。20世纪70年代中期已证实骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem，BMSCs)具有自我增殖能力和分化潜能，且具有来源广泛、取材简单、分化成骨的潜能强等特点，成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。

　　1  BMSCs体外增殖的生物学特性及培养

　　1.1  BMSCs的体外增殖生物学特性

　　干细胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化为两种以上不同类型组织细胞的细胞；组织干细胞是指发育成熟的个体内具有多向分化潜能的细胞，目前比较明确的能够转化的组织干细胞主要是BMSCs。对BMSCs的细胞周期研究表明，其大约有20％为静止期细胞，即G0期细胞。这表明BMSCs具有强大的增殖能力，每传一代细胞数量就增加2～4倍。但有文献报道，高度传代(大于25代)的BMSCs中有一部分已经表现出凋亡特性。

　　1.2  BMSCs的体外培养  　　Freidenstein发现了骨髓培养中有呈纺锤状的少量贴壁细胞，能够分化形成多种中胚层组织，包括：骨、软骨、肌腱、肌肉组织、骨髓基质结缔组织等，这种形成集落的初始骨髓基质细胞被称为成纤维细胞样细胞集落形成单位(Colony forming unitfirbroblastic，CFUF)。Minguell［3］认为BMSCs为存在于骨髓基质中的非造血来源的细胞亚群，Ashton称其为骨髓基质成纤维细胞。BMSCs对营养条件要求高，而且含量很低，约为0.001％～0.01％，要利用BMSCs就必须实现其体外分离培养及扩增［4］。　　BMSCs培养方法主要有全骨髓培养法和离心培养法。前者是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清(浓度为10％～20％)，塑料培养瓶较一般玻璃培养瓶更有利于BMSCs贴壁生长。细胞融合后以1∶2比例传代，3～4 d换液一次［5］。离心培养法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释，以1 500～2 000 r/min离心20～30 min，采集交界处的单核细胞层，缓冲液洗涤2～3次后，加入培养液接种培养。BMSCs接种密度的大小直接影响BMSCs的增殖能力。低密度接种(5000/cm2)BMSCs无论在扩增速度还是扩增倍数上都明显高于高密度接种。机体内BMMSC数量很少，接种数目太少会影响成骨率，太多对于临床应用又不太现实。段小军等在实验中研究发现，种植密度较高时严重影响BMSCs的贴壁生长，考虑为含有的红细胞、白细胞比重大于BMSCs而首先沉积于瓶底，且细胞代谢废物增多所致。研究表明每立方厘米载体接种1×106个细胞就能满足成骨要求。    　　低氧张力条件下培养BMSCs，其细胞增殖速度大大提高，且细胞碱性磷酸酶表达也大大增强［6］。考虑其原因是机体内氧分压明显低于外界(140 mmHg)，特别是骨髓内氧分压只为30～50 mmHg，大约相当于外界的1/3。因此BMSCs长期暴露于高氧分压条件下，必将导致细胞过度氧化，功能下降。如果体外进行培养的条件与体内氧分压相似，则更利于细胞功能的保留。    　　顾祖超等［7］人在实验中发现，兔BMSCs原代培养，其开始贴壁(1～2 d)的时间和完全贴壁时间(12～24 d)均长于传代培养的BMSCs，传代的BMSCs不形成集落，形态更加单一，呈梭形，14 d内没有形成明显的钙结节。BMSCs经诱导后的形态主要为多角形，其贴壁率有所下降，且在12～14 d内形成明显钙结节。传代细胞与诱导细胞两者的生长曲线无统计学差异，倍增时间为33.6～34.6 h，生长高峰均在接种后6～7 d出现。BMSCs长满单层后，可出现多层生长，没有发生接触抑制。BMSCs其成骨活性随着供体年龄增长呈下降趋势，年龄越大在培养中形成的群落和具有成骨样细胞特点的细胞越少，而细胞对诱导因子的敏感性下降。

 目前，三维细胞培养技术已在骨组织工程中得到广泛应用，Kinoshita等［8］利用胶原凝胶载体培养BMSCs，发现三维的胶原网络能有效的刺激成骨细胞分化；Glowacki等［9］采用培养液灌注造成动力性三维细胞培养环境，增加了细胞的适应生存能力及成骨功能。三维细胞培养能够有效地种植功能细胞、保持旺盛的细胞活性、最大程度地发挥细胞的功能。特别是流体力学刺激可通过PGE2途径将力学刺激转导至细胞内发挥调节作用，能够明显增加成骨细胞增殖，总蛋白合成和DNA合成增加［10］。

　　2  BMSCs的定向成骨分化

    BMSCs具有多方向分化的特点，在不同的体外环境诱导下可向不同组织分化，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，所以BMSCs的定向诱导具有重要的作用。目前诱导分化的方法可大致分为两种：一是在化学药物作用下诱导进行BMSCs分化(如地塞米松、1.25(OH)2D3、β磷酸甘油、维生素C等)；二是在细胞因子作用下诱导进行定向BMSCs分化(如BMP、TGFβ、bFGF等)。虽然通过体内外研究证明这些药物和因子的确在定向分化方面有独特的作用，但迄今为止，对这些诱导物的作用机制知之甚少，而且不同诱导剂的作用又不尽相同［11～12］。

　　2.1  化学药物作用下诱导BMSCs分化

　　大量实验研究发现：地塞米松作用于BMSCs后，骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性增强，骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白的合成明显增加。地塞米松可促进BMSCs的成骨分化，早期以促进基质合成为主，后期以促进矿化为主。地塞米松促进成骨的同时，亦诱导细胞向脂肪分化。Beresford［11］在传代培养细胞中加入1.25(OH)2D3，则抑制其向脂肪细胞转化，骨钙蛋白mRNA表达增加，证实向成骨细胞转化占优势，而仅在传代培养细胞中加入地塞米松时，则多向脂肪细胞转化，这主要是因为地塞米松促进成骨的同时，能激活BMSCs表面的糖皮质激素受体，而1.25(OH)2D3通过降低脂肪细胞晚期基因标志物ap2和脂肪的mRNA水平而抑制糖皮质激素诱导的脂肪形成［12］。βGP可释放磷酸根，为细胞矿化提供离子环境，可加速矿化结节的形成和骨钙素的合成。维生素C通过延长Ⅰ型胶原转录因子的半衰期而最终增加Ⅰ型胶原mRNA的含量。

　　2.2  细胞因子作用下诱导BMSCs定向分化

　　BMP、TGFβ、bFGF等细胞因子在骨髓间充质干细胞分化增殖中起着重要作用，但作用不一。BMP为特异性的骨生长因子，靶细胞为血管周围具有分化能力的间充质细胞，能够启动BMSCs的成骨过程，其作用机制：促进BMSCs分化为成骨细胞，引导成骨细胞成骨表型的表达，并增加矿化的形成；同时抑制脂肪细胞的形成，脂肪细胞晚期分化基因瘦素及蛋白合成降低，细胞中脂滴减少［13～14］。BMP为唯一具有异位成骨能力的生长因子，可诱导诱导性骨祖细胞(Inducible osteogenic precursor cell，IOPC)向定向性骨祖细胞(Detenined osteogenic precursor cell，DOPC)分化，这一特征为骨组织工程的临床应用提供了广阔前景。TGFβ是较强的促成骨分化因子，在体内能够增强BMP的诱导成骨作用。TGFβ主要是通过促进间充质干细胞分裂增殖，为BMP提供丰富的靶细胞；抑制脂肪细胞生成；促进骨细胞产生Ⅰ型胶原，抑制软骨细胞产生Ⅱ型胶原，增强基质钙化及对周围的成骨细胞的趋化作用，三方面提高BMSCs的成骨效应。bFGF是一种促进血管生成因子，在骨移植时可促进局部毛细血管生长。bFGF能够促进BMSCs体外培养CFUF的形成，促进细胞增殖。bFGF可促进BMSCs增殖的同时抑制其向成骨细胞分化；bFGF对Ⅱ型胶原蛋白的合成有促进增殖作用，而对于Ⅰ型胶原的影响比较复杂，可能bFGF是通过与细胞膜上bFGF受体结合及一系列信号传导最终激活DNA结合蛋白，作用于靶细胞上特异的bFGF反应元件起作用。Martin［15］研究表明：bFGF对BMSCs具有最强的促分裂作用，与BMP2联合应用促BMSCs转化作用强于应用单一细胞因子。骨的生长代谢是由多种细胞因子、化学物质、物理、生物因素等同时参与调节的过程，目前倾向于多因素联合应用或序贯使用。

3  基因技术在成骨方面的应用

    近年来多种骨生长因子调控基因分离成功及成骨机制的分子水平研究的不断深入，基因转移技术已广泛用于骨组织工程领域，通过导入标志基因或治疗性基因，可致外源性调节基因表达于修复区，实现诱导成骨、免疫调节或成骨调控等预定目的。

    Lou［16］以腺病毒介导hBMP2基因转移，使同质BMSCs分化为成骨细胞表型，表达了ALP活性。将其注入裸鼠体内，有异位钙化产生，且靶细胞的成骨活性依赖于腺病毒载体所表达的BMP剂量。有文献报道用腺病毒介导的TGFB1基因转染成骨细胞7 d后，靶细胞TGFB1的产生量是对照组的46倍，Ⅰ型胶原合成上升5倍，表现出良好的成骨活性［17］。金丹等［18］人使用含hBMP7基因的重组逆转录病毒感染兔BMSCs。结果显示转染后的BMSCs与对照组(空载体转染的BMSCs)在细胞增殖和细胞周期方面无显著差异，但合成胶原量上发生改变，在细胞增殖周期并无变化，所以可应用与进一步的体外构建［19.20］。相应的实验结果表明，转基因后的BMSCs在治疗骨缺损上明显优于单纯BMSCs或BMSCs复合成骨诱导剂的植入。

　　4  问题及展望

    总之，关于BMSCs的研究有了较大发展，但将BMSCs应用于临床，仍面临许多问题：a)BMSCs体外定向分化培养尚未探索出成熟的方法，分离纯化细胞群的技术有待进一步提高；b)BMSCs实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索；c)如何促进BMSCs与载体材料相容生长并成骨的难题有待进一步解决；d)基因转染时如何有效控制调控转入基因，使之适时适量表达，同时避免不良后果。随着三维细胞培养移植模型的进一步发展、基因转染技术的完善和生物可降解材料的日趋成熟，BMSCs移植将有更广阔的前景，骨缺损、骨不连的治疗将进入一个工程化修复重建的崭新领域。

【参考文献】  　　　［1］杨柳，段小军.骨组织工程学中种子细胞研究的前沿问题［J］.中国临床康复，2002，6(4)：532533.

　　［2］裴国献，金丹.骨组织工程学种子细胞研究进展［J］.中华创伤骨科杂志，2003，5(1)：5558.

　　［3］Minguell JJ，Erices A，Conget P.Mesechymal stem cells［J］.Exp Biol Med，2001，226(6)：507520.

　　［4］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411)：143147.

　　［5］舒胜文，李盛琳，马绪臣，等.大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究［J］.现代口腔医学杂志，2002，16(2)：9799.

　　［6］Lennon DP，Edmison JM，Caplan AL.Cultivation of rat marrowderived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension：effect on in vitro and in vivo osteochondrogensis［J］.J Cell Physiol，2001，187(3)：345355.

　　［7］顾祖超，李起鸿，赵玉峰，等.兔骨髓基质细胞在诱导条件下的成骨特性［J］.第三军医大学学报，2002，24(5)：527530.

　　［8］Kinoshita S，Finnegan M，Bncholz RW，et al.Threedimension collagen culture promotes osteoblast henotype in bone marrow derived cells［J］.Kobe J Med Sci，1999，45(5)：201211.

　　［9］Glowacki J，Mizuno S，Greenberger JS.Perfusion enhances function of bone marrow stromal cells in threedimension culture cell transplant［J］.1998，7：319326.

　　［10］Saris DB，Sanyal A，An KN，et al.periosteum responds to dynamic fluid pressure by proliferation in vitro［J］.J Orthop Res，1999，17(5)：668677.

　　［11］Beresford JN，Joyner CJ，Devlin C，et al.The effects of dexamethasone and 1，25dihydroxyvitamin D3 on osteogenic differentiation of human marrow stromal cells in vitro［J］.Arch Oral Biol，1994，39(11)：941947.

　［12］Kelly KA，Gimble JM.1，25Dihydroxy vitamin D3 inhibits adipocyte differentiation and gene expression in murine bone marrow stromal cell clones and primary cultures［J］.Endocrinology，1998，139(5)：26222628.

　　［13］Gori F，Thomas T，Hicok KC，et al.Differentition of human marrow stromal precursor cells：bone morphogenetic protein2 increases OSF2/CBFAI，enhances osteoblast commitment，and inhibits late adipocyte maturation［J］.J Bone Miner Res，1999，14(9)：15221535.

　　［14］Gimble JM，Morgan C，Kelly K，et al.Bone morphogenetic proteins inhibit adipocyte differentiation by bone marrow stromal cells［J］.J Cell Biochem，1995，58(3)：393402.

　　［15］Martin I，Muraglia A，Campanile G，et al.Fibroblast growth factor2 supportsex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow［J］.Endocrinology，1997，138(10)：44564462.

　　［16］Lou J，Xu F，Merkel K，et al.Gene therapy：adenovirusmediated human bone morphogenetie protein2 gene transfer induce mesenchymal progenitor cell proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo［J］.J Orthop Res，1999，17(1)：4350.

　　［17］Mehrara BJ，Saadeh PB，Steinbrech DS，et al.Adenovirusmediated gene therapy of osteoblasts in vitro and in vivo［J］.J Bone Miner Res，1999，14(8)：12901301.

　　［18］金丹，裴国献，齐凤菊，等.hBMP7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成的影响［J］.解放军医学杂志，2002，27(6)：475476.

　　［19］路继业，王岩，蔡胥.骨髓基质干细胞成骨的研究进展［J］.中华创伤骨科杂志，2004，6(5)：578580.

　　［20］柴岗，张艳，王敏，等.增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响［J］.中华创伤骨科杂志，2003，5(2)：142145.