基质金属蛋白酶9在骨肉瘤中的表达及其意义

作者：胡辉东,文会龙,陈金福

作者单位：常州市第四人民医院骨科，江苏 常州 213001

   【摘要】  目的 研究骨肉瘤组织中基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达情况，探讨它与骨肉瘤的关系和临床意义。方法 对29例骨肉瘤和19例正常骨组织分别石蜡切片，免疫组化了解MMP9在各组中的表达；提取两组总RNA行RTPCR，观察各组MMP9 mRNA转录改变，了解MMP9 mRNA与骨肉瘤的关系。结果 骨肉瘤组织中MMP9蛋白表达明显较正常组高，P＜0.05；正常骨组织中MMP9 mRNA的表达与βactin比值为0.39±0.12，在骨肉瘤组织中比值为0.78±0.04，两组间比较显示，骨肉瘤组织MMP9 mRNA的表达明显升高，P＜0.05。结论MMP9在正常骨组织中呈低表达,而在骨肉瘤中的表达明显上调，MMP9与骨肉瘤的发生发展密切相关。

【关键词】  骨肉瘤；基质金属蛋白酶9；表达

　　Expression and Significance of Matrix Metalloproteinase 9 in Osteosarcoma

　　HU Huidong，WEN Huilong，CHENG Jinfu，et al

　　（Department of Orthopedics，Changzhou Fourth Renmin Hospital,Changzhou Jiansu 213001,China）

　　ABSTRACT：Objective To study the relationship between matrix metalloproteinase 9 (MMP9) mRNA expressions in osteosarcoma and its clinical significance.Methods The expressions of MMP9 were known in 29 cases of osteosarcoma and 19 cases of normal bone tissues specimens by RTPCR.To observe the change of expressions of MMP9 mRNA and to detect MMP9 protein expression by innunhistochemical staining for every group.Image analysis technique was applied for determing the average optical level of the expressed protein.Then determin the dependance between the MMP9 gene and the invasiveness of osteosarcoma.Results Compared with control group,the average optical level of MMP9 of osteosarcoma were higher（P<0.05）.In osteosarcoma the ratio of  MMP9 mRNA straps and βactin was 0.78±0.04,there was significant difference(P<0.05) in comparison with 0.39±0.12 in normal bone tissues.The expressions of MMP9 mRNA in osteosarcoma were increased.Conclusion The expression of MMP9 in osteosarcoma was markedly higher than in normal bone tissues.MMP9 can promote the devolepment of the osteosarcoma.    　　KEY WORDS:Osteosarcoma;Matrix metalloproteinase 9;Expression

　　骨肉瘤是常见于青少年的恶性肿瘤,具有侵袭力强、转移早且转移率高等特点。血管生成是骨肉瘤生长和转移的关键步骤。近年来的研究表明,基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases,MMPs) 与血管生成的关系十分密切。MMP9 是MMPs中较重要的一种,是降解基底膜的主要酶类。MMP9 参与的基质降解及再塑形与间质血管发生关系密切。本研究通过29例骨肉瘤患者MMP9 mRNA的表达了解MMP9在骨肉瘤中的表达及意义。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料    　　来自我科2004～ 2006年手术切除骨肉瘤的患者29例。骨肉瘤标本均为新鲜标本。正常骨组织19 例作对照。骨肉瘤患者29 例，男16 例,女13例,年龄8～24 岁,平均21.2岁。病理分类:骨母细胞型骨肉瘤10例,软骨母细胞型骨肉瘤7 例,纤维母细胞型骨肉瘤4 例,其他类型骨肉瘤8 例(包括血管扩张型、混合型等)。

　　1.2  免疫组织化学法检测MMP9    　　按SP免疫组化试剂盒说明检测MMP9的表达（MMP9多抗购于武汉博士德生物制剂有限公司）。每例患者标本随机切取3张不同的切片，每张切片随机选取10个视野，在病理图像分析仪下，用高倍（×200）分别测定阳性细胞的平均光密度值。

1.3  逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测MMP9基因    　　（1）总RNA提取用Trazol溶液，液氮研磨提取骨肉瘤组和正常组总RNA。用紫外分光光度计测量各组样品RNA 260、280nm吸光值，根据OD260/OD280确定RNA的完整性与纯度，根据OD260调节样本浓度至(1.5～1)μg/μl。    　　（2）RTPCR用逆转录试剂盒（Invitrogen公司）将两组RNA合成cDNA。人类MMP9基因mRNA大小为2387bp,引物设计为：上游引物5′TTGACAGCGACAAGAAGTGG3′；下游引物5′CCCTCAGAGAATCGCCAGTA3′。扩增片断大小为500bp的内参照基因βactin，上游引物:5′CTGACTGACTACCTCATGAAGATC 3′,下游引物:5′GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3′,扩增产物248bp。吸各组cDNA产物1.5μl为模板，依次加入dNTP 1μl,10×buffer(含Mg＋＋)2.5μl，稀释后的上下游引物各1μl，Taq酶(Promega公司)0.5μl，加灭菌双蒸水补足至25μl体系。混匀后立即上PCR仪，94℃预变性5min,在94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸1min条件下扩增35个循环，72℃终末延伸4min,保存4℃。均在1.5%琼脂糖凝胶上电泳观察扩增产物特异条带并摄像。

　　1.4  统计学分析    　　各项指标测得的数据均用±s表示，应用SPSS11.5软件包对所得结果进行统计分析。 两样本均数比较用组间t检验，P﹤0.05，差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  MMP9免疫组化检测结果    　　MMP9在骨肉瘤组织胞浆中表达明显，平均光密度值为0.3862±0.0400；在正常对照组中表达较少，平均光密度值为0.1546±0.0300。两组平均光密度值比较差异有显著性，P＜0.05。（表1，图1）

　　表1  两组MMP9免疫组化及RTPCR的比较（略）

　　与正常骨组织比较， *P<0.05

　　图1  骨肉瘤组织中MMP9免疫组化表达（SP×200）（略）

　　2.2  RTPCR检测MMP9基因结果    　　电泳显示，在正常骨组织中MMP9 mRNA的表达与βactin比值为0.39±0.12，在骨肉瘤组织中比值为0.78±0.04。两组比值比较显示，骨肉瘤组织MMP9 mRNA的表达明显升高，P＜0.05。（表1，图2）

　　图2  正常骨组织与骨肉瘤组织中MMP9mRNA表达结果。（略）

　　(M为Marker,1为正常骨组织，2为骨肉瘤组织)。

　　3  讨论    　　MMPs是一组能降解细胞外基质的酶活性依赖的锌离子蛋白酶超家族，是一组能降解所有细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的蛋白酶类。ECM是维持骨组织结构完整的重要成分。根据MMPs作用底物不同又分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素等类。明胶酶包括明胶酶 A（MMP2）和明胶酶B（MMP9）。癌细胞发生侵袭和转移,Ⅳ 型胶原含量的改变是该过程的重要阶段。Ⅳ 型胶原酶(包括MMP2 和MMP9) 是基质金属蛋白酶家族中的主要成员。MMP9 是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,主要通过直接降解细胞外基质和基底膜成分，调节肿瘤细胞与基质的粘附，激活具有潜在活性的蛋白质等作用来促进肿瘤细胞的侵袭转移[1，2]。MMP9除参与肿瘤的浸润转移外，还可活化转化生长因子β、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α，并可从纤溶酶原中释放出血管他丁（angiostatin ）[3]。MMP9一方面通过降解细胞外基质而降低了血管生成的阻力，另一方面通过活化和释放血管生成因子而促进了肿瘤血管的生成[4]。    　　本组研究中我们发现MMP9基因在正常骨组织中低表达,而在骨肉瘤组织中高表达,两者有显著性差异(P<0.05)。提示骨肉瘤中MMP9主要来源于肿瘤细胞，MMP9基因激活及表达可能是骨肉瘤发生发展的重要因素。MMP9可能成为骨肉瘤诊断和治疗的一项有用的指标,并且可能为骨肉瘤的治疗提供一个新的、有用的靶基因。抑制MMP9基因表达和(或) 生物活性,有可能成为防治骨肉瘤发生和发展的潜在途径之一。

【参考文献】  　　[1]Mccawley LJ,Matrisan LM.Matrix metalloproteinases:they are not just for matrix anymore[J].Curr Opin Cell Biol,2001,13:534

　　[2]Kerkela E,SaarialhoKere U.Mat rix metalloproteinases in tumor progression:focus on basal and squamous cell skin cancer[J].Exp Dermatol,2003,12 (2):109

　　[3]Patterson BC,Sang QA.Angiostatinconverting enzyme activities of human Matrilysin (MMP7) and gelatinase B/type IV collagenase (MMP9)[J].J Biol Chem,1997,272:2882

　　[4]Shapiro SD.Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix:biological consequences[J].Curr Opin Cell Biol,1998,10:602