氧化应激对激素性股骨头缺血坏死微血管的损伤作用

作者：强辉，王坤正，高培国，张明宇，时志斌，杨华清    作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院骨科，陕西西安 710004；2. 西北工业大学医院骨科，陕西西安 710072

【摘要】 目的 探讨氧化应激在激素性股骨头缺血坏死微血管损伤中的作用。方法 选择不同原因的股骨头缺血坏死患者30例，按病因分为A组(激素性)、B组(酒精性)和C组(特发性)，每组10例；另选10例股骨颈骨折患者设为D组(正常对照)。测定血清总抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)，观察氧化应激水平；Verhoeff氏染色法观察微血管损伤情况；透射电镜观察股骨头组织的超微结构。结果 A组TAOC、SOD、GSHPX、GSH、MDA水平较其他组变化显著(P<0.05)，其他组间无显著差异；Verhoeff氏染色结果显示A组微动脉损伤阳性率明显高于其他组(P<0.05)，其他组间无显著差异；透射电镜下A组骨组织中微动脉管壁不完整，闭锁的微动脉多见，内皮细胞结构不清，凋亡细胞多见，较B、C组损伤程度重。结论 氧化应激可能通过微动脉损伤途径在激素性股骨头缺血坏死的发病中起重要作用。

【关键词】  氧化应激 股骨头缺血坏死 微血管损伤

　　Microvascular injury of femoral head avascular necrosis　caused by steroidinduced oxidative stress

　　QIANG Hui, WANG Kunzheng, GAO Peiguo, ZHANG Mingyu, SHI Zhibin, YANG Huaqing

　　1. Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 71004; 2. Department of Orthopedics,Hospital of Northwestern Polytechnical University, Xian 710072, China

　　ABSTRACT: Objective  To explore the microvascular injury of femoral head avascular necrosis caused by steroidinduced oxidative stress. Methods  Thirty patients with multiplecause avascular necrosis of femoral head were selected and divided into 3 groups (10 in each group): Group A (hormone group), Group B (alcoholic group) and Group C (idiopathic group). Group D served as control group. We determined serum totalantioxidative capability (TAOC), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSHPX), glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA ) to observe the level of oxidative stress. Microvascular injury was observed by Verhoeff staining. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of the femoral head. Results  In Group A, TAOC, SOD, GSHPX, GSH and MDA levels changed more obviously than those in the other groups (P<0.05), and there were no significant differences among the other groups. Verhoeff staining showed that the positive rate of arteriole damage in Group A was significantly higher than that in the other groups (P<0.05), and there were no significant differences among the other groups. Under the transmission electron microscope, bone tissue arteriole wall in Group A was not complete, with more atresic arterioles, unclear endothelial cell structure and more apoptotic cells than in Groups B and C. Conclusion  Oxidative stress may damage the artery through microchannels in steroidinduced avascular necrosis and plays an important role in the pathogenesis.

　　KEY WORDS: oxidative stress; avascular necrosis of the femoral head; microvascular injury

　　股骨头缺血坏死(avascular necrosis of the femoral head, ANFH)最常见的原因是过量使用激素。由于糖皮质激素的广泛应用，激素性ANFH的发病率呈逐年升高的趋势[1]。微血管损伤被认为是激素性ANFH重要的病理过程，但对引起微血管损伤的因素仍认识不够。氧化应激导致的血管损伤在多种疾病中的作用是目前研究的一大热点。动物实验发现氧化应激可能在激素性ANFH的发病中扮演着重要角色[2]。本研究以不同原因的ANFH患者为研究对象，探讨氧化应激在激素性ANFH微血管损伤中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1 研究对象及分组  　　选择ANFH患者30例，按病因分A组(激素性)、B组(酒精性)和C组(特发性)，每组10例；另选10例股骨颈骨折患者设为D组(正常对照)。其中男性24个，女性16个，年龄31～76岁，平均54岁。根据X线检查，按Ficat分期标准确诊为Ⅲ、Ⅳ期。股骨头标本数：A组14个，B组11个，C组10个，D组10个。所有研究对象在采集血液标本之前1个月内,未服用抗氧化药物，所有股骨头标本通过全髋关节置换术获得。本研究均征得患者的知情同意。

　　1.2 血清中氧化应激指标的检测  　　应用总抗氧化能力(totalantioxidative capability, TAOC)测试盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutas, SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPX)测试盒、还原型谷胱甘肽(glutathone, GSH)测试盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)测试盒分别对血清中相应指标进行检测。以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.3 股骨头组织Verhoeff氏染色

　　取新鲜股骨头标本，用利锯沿冠状面分割取其前外上方，大小为0.5cm×0.5cm×0.4cm的骨块，于100mL/L甲醛溶液固定，150g/L乙二胺四乙酸(EDTA，pH 7.4)脱钙8周，石蜡包埋，切成0.5μm厚的连续切片，进行Verhoeff氏染色。然后根据随机抽样原则，在各个标本的每种染色片中随机抽取5张切片观察动、静脉的各层结构、平滑肌细胞及血管内皮细胞的形态。

　　1.4 股骨头组织的透射电镜观察

　　新鲜的股骨头标本取出后切成1mm3小块，立即置于25mL/L的戊二醛固定，100g/L EDTA脱钙4周，10g/L四氧化锇再固定，制作超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，日立H600透射电子显微镜观察骨组织结构、血管壁结构、血管内皮细胞及骨细胞的形态。

　　1.5 统计学分析

　　所有数据应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。氧化应激指标采用单因素方差分析，所获数据以均值±标准差(±s)表示。各组中血管损伤的阳性率采用确切概率法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1  各组氧化应激指标的比较

　　ANFH各组的TAOC均较对照组有所下降，显示ANFH患者体内氧化应激水平提高，其中A组升高最明显(P<0.05)。在ANFH各组中，抗氧化指标SOD、GSHPX、GSH均较对照组减少，而MDA水平均高于对照组。A组的氧化、抗氧化指标与其他组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。B、C、D组间氧化应激水平无明显差异(P>0.05，表1)。表1  各组患者血清中氧化应激指标的比较（略）

　　2.2  Verhoeff氏染色结果

　　A、B、C组可见：微动脉出现基底膜断裂、脱落，内弹力板变性增厚(图1A)；有些微动脉基底膜增生、断裂，内弹力板退行性变，失去弹力纤维和胶原纤维(图1B)；微静脉血管壁结构正常(图1C)。D组微动脉及微静脉管壁未见病理变化(图2)。A组血管损伤阳性率为71.43%(10/14)，显著高于B组的30.36%(4/11)和C组的30%(3/10)(P<0.05)，B组稍高于C组，但无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 透射电镜观察结果

　　A组微动脉管壁不完整，闭锁的微动脉多见，内皮细胞结构不清，细胞核染色质边集，凋亡细胞多见(图3)；B、C组微动脉内皮细胞等损伤程度较A组轻微，凋亡细胞少见。

　　3 讨 论

　　氧化应激是指能导致化学或者代谢来源的活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生的一种细胞内或细胞外的状态。人体内氧化应激形成是体内抗氧化系统如SOD、GSHPX、GSH等防御机能减弱或是体内ROS产生过多的结果[3]。氧化应激使机体处于易损状态，同时也增强了致病因素的毒性作用，并与多种疾病存在着病因学关系。

　　本研究结果显示，ANFH各组的SOD、GSHPX、GSH水平均较对照组下降，MDA水平均高于对照组，而仅激素组ANFH患者各指标较其他组有显著性差异(P<0.05)。可见，ANFH患者处于氧化应激状态，而且激素性ANFH患者更为严重。有研究显示，激素可能通过氧化应激途径产生骨坏死[4]。因为激素过量应用会造成人体全身较其他因素更重的负面影响，氧化还原状态严重失衡，产生氧化应激，使机体处于易损状态；同时这又增强了激素对骨骼系统的毒性作用，破坏骨骼血液循环系统，导致骨坏死。此外，ICHISEKI等[5]利用促氧化剂建立实验模型，也观察到单纯氧化应激可诱导、发生股骨头坏死。

　　本研究通过透射电镜观察到激素性ANFH中凋亡细胞比酒精性、特发性ANFH多见。另有研究通过TUNEL染色发现，激素性ANFH中凋亡细胞数比酒精性、特发性ANFH明显增多[6]。这提示：在ANFH凋亡机制中，激素相对其他病因有更强的诱导细胞凋亡作用。研究显示，氧化应激与细胞凋亡之间存在着密切的关系，而且人们发现能够诱导细胞凋亡的化学因素同样也是导致细胞发生氧化应激的诱因[7]。因此，我们认为，氧化应激在激素性ANFH病理机制中起更为重要的作用。

　　 本研究的Verhoeff氏染色结果显示，ANFH患者股骨头组织内微动脉存在不同程度损伤，激素导致的损伤更广泛，而小静脉管壁结构、内膜无明显增生及断裂。由此可见，ANFH的病理过程，尤其是激素性ANFH，必然通过造成微动脉损伤引起股骨头组织缺血坏死。此外，激素还能抑制股骨头内微血管的生长和再生，加速其闭合与退化，进一步加速股骨头缺血坏死进程[8]。

　　我们前期的实验研究显示，血管内皮损伤在激素性ANFH中起关键作用[911]。另有动物实验报道，保护血管内皮细胞对激素性ANFH起一定的防治作用[12]。SEGUIN等[13]通过对比研究发现，在ANFH患者体内，血管内皮细胞独立于其他因素而发生明显受损、功能障碍，认为其与ANFH存在必然联系。这与本研究通过透射电镜观察到血管内皮细胞改变相对应。本研究结果还显示，激素组ANFH微动脉损伤的阳性率显著地高于其他组(P<0.05)。这进一步显示，微血管损伤与激素性ANFH的关系更为密切，激素较其他因素有更广泛的微动脉损伤作用。

　　显然，GSH的减少对细胞膜稳态、细胞骨架维持及其相应组织成分如糖、脂肪及蛋白质代谢来说都是非常重要的[14]。因为GSH通过抑制脂质过氧化物增加，稳定溶酶体膜、保持细胞内氧化还原反应平衡、阻止代谢机能紊乱恶化，抑制血管内皮细胞、血管壁损伤[14]。同时，MDA由脂质过氧化产生，通过破坏细胞膜磷脂、损伤胞膜，显著地损伤血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞[15]。此外，MDA破坏SOD、GSHPX的活性部位，导致酶活性丧失，造成机体抗氧化能力减弱[16]。这种氧化应激造成的恶性循环将持续造成血管内皮、微血管损伤，不断加重对股骨头的破坏作用，最终导致骨坏死。    　　综上所述，氧化应激可能通过微动脉损伤途径破坏股骨头微循环，在激素性ANFH发病中起重要作用。但由于本研究样本量较小，氧化应激在激素性ANFH中作用的确切机制仍需进一步深入研究。

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