缺血预适应介导的内皮祖细胞对保留肾单位手术后肾功能的保护作用

保留肾单位手术(NSS)过程中的肾脏缺血性损伤为一个普遍存在的问题,尚未引起人们的足够重视.Li等月〕在心血管领域中的研究结果显示:缺血预适应(IPC)可通过介导内皮祖细胞(EPCs)归巢,对心肌缺血性损伤产生修复作用.目前IPC在缺血性肾损伤中的研究报道尚少.我们通过建立大鼠1VSS,IPC+NSS模型,探讨IPC对NSS后肾功能的保护作用及其机制.　　材料与方法　　1.材料:雄性SD大鼠,体质量200一250,购于南京医科大学实验动物中心(动物使用许可证号:S}XK(苏)2009-0015).血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子一1a(SDF-1a)、胰岛素样生长因子一1(IGF-1)多克隆抗体(SantaCru:公司)、异硫氰酸荧光素(FITC)-CD34单克隆抗体(SantaCruz公司)、血管内皮生长因子受体(F'lk)多克隆抗体(NovusBiologi-cals公司)、山羊抗兔I}G-藻红蛋白(PE,SantaCruz公司)、增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(Ahcam公司)2.模型建立及动物分组:SD大鼠均以10plc水合氯醛腹腔注射麻醉,背部切口暴露右侧肾脏,结扎肾蒂及输尿管后切除右肾,术后1周随机分为对照组6ham、保留肾单位组(NSS)、缺血预适应+保留肾单位组(IPC);Sham组仅暴露左侧肾脏八SS组在夹闭肾蒂40min的同时切除左肾下级(约占全肾体积1/3),明胶海绵压迫止血;IPC组在阻断肾蒂前给予15min缺血/10min再灌注处理,余同NSS组以上模型建立参照Jia等2〕以及Ramakumar等z的实验研究恢复血供后1,3,612,24h及3d处死大鼠,每组各时间点5只留取外周血、残余肾脏做后续检测.　　3.血生化:抽取大鼠下腔静脉血2m1,2000r/min离心10min,取上清利用(OlympusAL2000全目动牛化分析仪检测血肌配(Scr)、尿素氮(BL)水平.　　4.组织学检测:采用4rl}多聚甲醛固定肾脏,进行乙醇脱水、石蜡包埋,制作厚5}.m切片,进行苏木素-伊红(HE)染色,对肾脏组织进行病理学评估.　　5.流式细胞术:将肾脏组织剪碎,经胰蛋白酶恒温箱消化30min,400目不锈钢筛网过滤,2000r/min离心10min,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次,去除碎片倒置显微镜下计数细胞,取约1\106个细胞,加人Flk多克隆抗体混匀后室温孵育30min,2mlPBS漂洗,加人FITC-CD34单克隆抗体,山羊抗兔艳G-PE,混匀后避光室温孵育30min离心弃__[清,2mlPBS漂洗,上流式细胞仪检测6.免疫组织化学检测:’肾组织蜡块制成厚5}.,m切片,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后,血清封闭加人PCNA单克隆抗体40C过夜,PBS洗片后辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG,37℃孵育2h,洗片后加二氨基联苯胺(DAB)底物显色液15min,苏木素衬染,树脂封片后于显微镜下观察.　　7.Westernblot检测:利用液氮将100mg肾组织研磨至粉末状,全蛋白提取试剂盒提取总蛋白,加入上样缓冲液煮沸变性5min,行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE).采用半十转方式将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h,加人一抗(1:500)4℃过夜TEST洗膜15minx3次后加入相应二抗,室温孵育2hTBST洗膜15minx3次后曝光,结果经UVP凝胶成像及分析系统分析和保存_8统计学方法:应用SPSS16.0统计软件分析,资料均用均数士标准差(x士,)表示方差齐时多组间资料比较采用}NO}iA分析,两两比较采用SNK法;方差不齐则采用非参数检验、结果　　1.大鼠模型建立:右肾切除后大鼠存活率为100%,1周后行NSS_NSS组死亡率为10.0%(3!30),IPC组死亡率为6.7%(2/30).死亡时间均在24}481:与肾脏病理学损伤最严重的时间相一致,两组差异无统计学意义(P>0.05).　　2.大鼠血生化检测:与Shan:组比较,NSS组与IPC组大鼠Scr,BL水平明显升高,在24h左右达到顶峰(P<0.05,随后逐渐下降_再灌注后12一72h,IPC组Scr较NSS组降低(P<0.05),再灌注24 72h,IPC组BUN较NSS组降低(P<0.05,图1).　　3.大鼠肾脏组织学检测:Sham组各时间段均无肾小管损伤.wss组渗出明显增加,出现管型及管腔扩张,管周细胞脱落,以24h最为显著;IPC组亦有上述病理学改变,但较NSS组损伤减轻.N}SS组与IPC组肾小管损伤评分在所有时间点均明显高于Sham组(P<0.05)与iVSS组比较,IPC组肾小管损伤评分在12一24h降低(P<0.O5,表1).　　4.流式细胞术:CD34,Flk为EPC、表面标志物,双阳性细胞即为EPCs.与Shan,比较,IPC组与NSS组肾脏中EPCs含量在所有时间点均明显增加(P<0.05)恢复灌注I2h后,IPC组肾脏EPCs含量高于同时期NSS组(5.75士0.71)%比(2.92士0.71)%,P<0.O5〕恢复灌注3d后两组肾脏EPCs含量差异无统讨一学意义(P>0.05)5.免疫组织化学检测EPCs增殖:PCN_}是细胞增殖的标志物.Sham组几乎无EPCs增殖,NSS组可见部分EPCs增殖,但数量少,染色较浅IPC组与NSS组比较EPCs增殖明显增多,增殖的EPC.:集中在髓质肾小管周围毛细血管6.Westernblot检测结果:IPC组、ECF蛋白表达在1,3,6h高于NSS组及Sham组(P<0.05),其余时间点差异无统计学意义(P>0.05),NSS组与Sham组VEGF蛋白表达在各个时间点差异无统计学意义(P>0.O5.与Sham组比较,IPC组与NSS组SDF-1.蛋白表达在24h升高(P<0.05),且IPC组升高较VSs组升高更为显著(P<0.05)_3组IGF-I蛋白表达在各个时间点差异无统计学意义(P>0.05,图2).　　讨论　　NSS为肾脏外科中的常用术式之一,因其具有最大限度保留肾功能、提高生活质量、降低心血管事件发生率等优点,在肾癌的治疗中正逐渐引起国内、外学者的关注L4-sJ.但是NSS中的缺血性肾损伤却普遍存在6一7〕.研究证实,IPC可对包括肾脏在内的许多脏器缺血性损伤产生保护作用2,s-91,本研究结果显示,IPC组大鼠肾脏功能学及形态学均较NSS组有明显改善,表明IPC可对因NSS导致的肾脏缺血性损伤产生明确的保护作用.　　Li等的研究结果显示IPC可动员内源性EPCs归巢至缺血心肌,后者通过整合作用,参与损伤血管内皮的修复,改善心功能.对肾脏的研究结果显示:IPC可动员EPCs至受损肾脏,后者可能与肾功能的恢复相关,但具体机制尚不清楚.本研究结果显示,与NSS组比较,IPC组肾脏EPCs含量在恢复灌注12-24h有明显增加,表明IPC可动员内源性EPCs归巢至损伤肾脏,此外,IPC组大鼠肾小管周围毛细血管内皮细胞增殖较NSS与Sham组明显增强它提示EPCs可能通过促进内皮细胞增殖发挥修复肾脏损伤的作用EPCs具有促进损伤组织再内皮化与微血管新生的功能,目前认为其机制主要分为两种:EPCs可直接整合人受损的毛细血管;EPCs通过分泌各种血管生长因子促血管新生及内皮修复本研究结果显示:经IPC处理后,大鼠肾组织脏中VEGF,SDF-1a蛋白表达明显上调,进一步证实了旁分泌因子在损伤肾组织中的修复作用本研究结果表明,15min/10minIPC方案可促进内源性EPC*归巢至损伤肾脏,EPC、通过分泌各种血管生长因子促进肾小管周围毛细血管内皮细胞增殖,从而对\SS后肾脏缺血性损伤产生保护作用.IPC具有操作方便、效果明确等特点,但在其作用机制、IPC方案的优化等方面尚需进一步研究.　　参考文献　　Li M,Nishimura H,Iwakura A. Endothelial progenitor cells are rapidly recruited to myocardium and mediate protective effect of ischemic preconditioning via "imported" nitric oxide synthase activity[J].Circulation,2005.1114-1120.　　Jia RP,Zhu JG,Wu JP. Experimental study on early protective effect of ischemic preconditionihg on rat kidney graft[J].Transplantation Proceedings,2009.69-72.　　Ramakumar S,Phull H,Purves T. Novel delivery of oligonucleotides using a topical hydrogel tissue sealant in a murine partial nephrectomy model[J].The Journal of Urology,2005.1133-1136.　　Kim JM,Song PH,Kim HT. Comparison of partial and radical nephrectomy for pTlb renal cell carcinoma[J].Korean J Urol,2010.596-600.　　Breau RH,Crispen PL,Jimenez RE. Outcome of stage T2 or greater renal cell cancer treated with partial nephrectomy[J].The Journal of Urology,2010,(3):903-908.doi:10.1016/j.juro.2009.11.037.　　Funahashi Y,Hattori R,Yamamoto T. Ischemic renal damage after nephron-sparing surgery in patients with normal contralateral kidney[J].European Urology,2009.209-215.　　黄建生,杨江根,方烈奎. 腹腔镜原位低温肾脏部分切除术的研究[J].中华实验外科杂志,2011,(12):2086-2089.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.12.019.