蛋白酶体抑制剂对面神经运动神经元的保护作用

　　　作者：刘南 作者单位：解放军第451医院神经内科，陕西 西安 710054

　　【摘要】 目的： 观察面神经损伤局部使用蛋白酶体抑制剂MG132对面神经运动神经元的保护作用. 方法： 制作大鼠面神经切断模型，12只大鼠随机分为治疗组与对照组，治疗组大鼠在面神经损伤同时局部使用MG132，而对照组则给予生理盐水. 术后观察面神经运动神经元的存活情况，并使用CTB逆标的方法观察面神经元轴突变性的情况. 结果： 给予蛋白酶体抑制剂MG132可以增加面神经损伤后面神经运动神经元存活数目(P<0.05)，且CTB逆标面神经元的数目也增加(P<0.05). 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132对损伤面神经具有保护作用.

　　【关键词】 面神经损伤 蛋白酶体抑制剂 神经纤维 凋亡

　　0引言

　　细胞凋亡是中枢神经系统发育和疾病过程中主要的细胞死亡方式，阻止细胞凋亡往往可以延缓或者阻止疾病的发生发展，因此选择合适的治疗策略抑制细胞凋亡是目前神经系统疾病主要的治疗方法[1]. 但是最近的研究发现，中枢神经系统部分神经元的凋亡是继发于其轴突变性而发生的. 体外实验也证实，抑制轴突的逆行性变性可以减少神经元的凋亡[2]. 因此，我们可以通过抑制轴突变性从而减轻中枢神经系统神经元的凋亡. 近来的研究发现泛素依赖的蛋白酶体是轴突变性过程的主要参与者之一，使用蛋白酶体抑制剂MG132可以延缓轴突的变性[3]. 本研究的主要目的就是通过在面神经损伤后局部使用蛋白酶体抑制剂MG132，观察其对面神经元的存活及面神经变性的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料SD雌性大鼠12只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量(200±10) g，随机分为实验组和对照组，每组6只. 成年大鼠手术方法参照文献，建立以左侧面神经断裂为实验对象的动物模型.

　　1.2方法麻醉(10 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg) 大鼠，暴露左侧茎乳孔及面神经干，于距茎乳孔1.5 mm处使用20的线结扎面神经，在结扎出的远端切除一段5 mm的神经干，右侧为正常对照. 将沾有20 mmol/L MG132的明胶海绵固定在全部动物按时给予食物和水，并经不同存活时间，在10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg) ip麻醉下开胸，左心室升动脉插管，灌注温生理盐水100 mL冲净血液，然后用预冷的40 g/L多聚甲醛固定液(pH 7.4)500 mL灌注，固定完毕，参照文献[4]定位面神经核，水平面切取一块5 mm脑干(以桥延沟为中心)后固定2 h，入200 g/L蔗糖溶液4℃过夜，至组织块下沉，冰冻冠状切片14 μm. 术后25 d于两组大鼠面神经损伤部位用微量注射器将1%的霍乱毒素B亚单位(CTB，Sigma)2 μL注入伤侧面神经干内.

　　大鼠面神经损伤后1，3，7，14 d分别在10 g/L戊巴比妥钠(50 mg/kg) 腹腔麻醉下开胸，左心室升主动脉插管，灌注温生理盐水100 mL冲净血液. 用预冷的40 g/L多聚甲醛固定液(pH 7.4)500 mL灌注，固定. 取损伤侧面神经,置于4℃，250 g/L蔗糖PB溶液过夜. 待组织沉底后行冰冻切片，片厚10 μm，每5张留取2张分别进行HE染色和NF160免疫组织化学染色. 切片使用PBS漂洗5 min×3次，在含有3 g/L TritonX100的山羊抗CTB抗体(1∶3000, Calbiochem)中室温过夜;用PBS漂洗5 min×3次后,依次加入二抗和ABC,常规DAB显色.

　　统计学处理：使用LEICA M550采集图像. 于选取的HE染色切片上，每套片子随机选取4张,计数损伤侧面神经运动神经元数目,计数标准为能辨认出细胞核的神经元轮廓者. 计数损伤侧CTB阳性的运动神经元数目，并计算平均值. 数据以x±s表示,并用 SPSS 11.0统计软件进行t检验分析.

　　2结果

　　2.1HE染色计数在HE染色切片上，面神经核神经元胞体较大，因此易于与其他细胞区分，便于计数. 面神经切断后28 d，伤侧与健侧相比，面神经核神经元数目下降明显，一部分神经元染色变淡,轮廓不清，伤侧存活神经元数为71.5±3.8. 给予MG132后，伤侧运动神经元存活数量提高至81.8±4.2. 同一大鼠伤侧与健侧相比，神经元(数目)无显著差异，而两组(伤侧)之间比较有显著性差异(P<0.01，图1).

　　A： 生理盐水注射组; B： MG132注射组.

　　图1面神经切断伤后28 d存活运动神经元HE ×10(略)

　　2.2CTB标记神经元计数CTB阳性的细胞全部为面神经核神经元. 损伤后28 d，MG132治疗组平均每张切片CTB标记的阳性细胞数为43.5±2.7，对照组为69.3±4.1，两组比较有显著性差异(P<0.001). 并且对照组与治疗组相比，运动神经元染色强度的变异较大(图2).

　　A： 生理盐水注射组; B： MG132注射组.

　　图2面神经切断术后28 d CTB逆标运动神经元HE ×10(略)

　　3讨论

　　多数研究表明，轴突切断后，损伤部位远侧端会发生沃勒变性，轴突内细胞骨架解聚，骨架蛋白被降解,而损伤部位的近侧端则发生回缩变性，严重的引起神经细胞的死亡. 传统观点认为，轴突变性是由于损伤后游离段失去了来自于神经元胞体的营养支持作用，所发生的被动死亡过程，但是最近的研究发现轴突变性是轴突对损伤的主动反应，给予适当的措施，可以延缓轴突的变性. 面神经是颅面部重要神经之一，由于其解剖结构独特，解剖位置表浅，因此使用啮齿动物的面神经损伤模型研究轴突变性可以简化手术操作并易于结果的分析[4]. 周柏玉等[5]研究了成型及新生大鼠面神经结扎后NOS的表达，发现成年大鼠面神经损伤后iNOS是引起继发损伤的主要因素. 我们的研究也证明，如果不给予任何干预措施，面神经完全夹伤3 d后，使用NF160染色可以看到其夹伤部位的远端靠近损伤部位的神经纤维几乎完全变性，因此我们可以利用这个模型检测药物对轴突变性的保护作用.

　　泛素蛋白酶体依赖的蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径之一，可以调控细胞的多种功能. 最近的研究发现，泛素蛋白酶体系统是轴突变性过程中主要的调控途径之一. MG132是可逆性蛋白酶体抑制剂的一种，可以抑制蛋白酶体对泛素化蛋白底物的水解. 研究认为，MG132可以诱导多种细胞发生凋亡，其机制可能与MG132抑制UPP活性，使细胞内Caspase3蛋白降解减少,以及促进细胞色素C的释放有关[6]. 在神经元胞体处给予MG132，可以引起神经元的凋亡，但是我们的研究发现面神经损伤的残端给予MG132不但减少了损伤末端轴突的变性而且减少了损伤侧面神经的死亡[7]. 我们的研究提示，MG132在轴突和胞体可能发挥着不同的作用. 在轴突，蛋白酶抑制剂可以抑制轴突的变性,从而对神经元起到保护作用.

　　神经元凋亡是神经损伤最主要的表现之一，长久以来对其研究的重点都集中在给与神经营养因子，抗凋亡以及减少自由基产生等治疗策略，这些策略的共同点都是直接围绕着如何抑制神经元凋亡而设计的，但是本研究提示，抑制轴突的变性也可以在一定程度上减少神经元的凋亡，从而为阻止神经元死亡以及神经变性疾病的治疗提供了新的治疗策略[8]. 由于目前已经有多种策略来抑制轴突的变性但是值得注意的是MG132在轴突和胞体所发挥的作用可能有所不同，这也使得我们必须使用合适的给药方式才能取得有效的治疗结果.

　　我们的研究表明蛋白酶体抑制剂(MG132)可以延缓轴突离断后其远侧端的变性，还可以减轻由于轴突离断后神经元的死亡，为防治神经变性疾病提供了一个新的切入点. 但是还有许多问题需要研究解决，蛋白酶体抑制剂的其它更合适、副作用更小的给药方式，最佳治疗剂量等等，都需要进一步研究.

　　【参考文献】

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