凋亡抑制基因XIAP在肾透明细胞癌中的表达

　　作者：宋涛　　作者单位：解放军总医院泌尿外科，北京 100853

　　【摘要】目的 研究凋亡抑制基因XIAP在肾透明细胞癌组织的表达情况，以探讨其与肾癌临床病理特征的关系。方法 应用反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学法，检测XIAP在70例肾透明细胞癌中的表达情况。结果 70例肾癌组织中XIAP基因高表达，XIAP蛋白阳性表达率74.2%，10例非肿瘤肾组织无1例XIAP表达阳性;随着病理分级和临床分期的逐渐升高，XIAP蛋白的表达也愈高，差异有统计学意义(P<0.05);XIAP的表达与肾癌的病理分级、临床分期相关(P<0.05)。结论 XIAP的表达与肾癌的病理分级、临床分期密切相关，XIAP可作为反映肾癌生物学行为的指标之一，有可能用于肾癌预后的判断。

　　【关键词】 XIAP 肾肿瘤 透明细胞癌 预后

　　Expression of apoptosis inhibiting gene XIAP in clear cell carcinoma of kidney　　SONG Tao,HONG Baofa,CAI Wei,et al　　Department of Urology Surgery,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China Abstract: Objective To study the expression of apoptosis inhibitor gene XIAP in clearcell renal carcinoma(RCC) and to investigate its clinical and pathological characteristic in RCC.Methods The expression of XIAP in 70 cases of RCC was detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction and immunohistochemistry.Results XIAP gene was not expressed in normal renal tissues(10 cases),but highly expressed in renal carcinoma tissues,the positive expression rate was 74.2%.Companied with pathologic grade and clinical stage heightening gradually,the expression of XIAP protein was also higher(P<0.05).The expression of XIAP was associated with pathologic grade and clinical stage of renal cancer (P<0.05).Conclusion XIAP is one of essential indexes to reflect biological behaviour of renal cancer,and it may serve as a marker to judge prognosis of renal cancer.

　　Key words: XIAP;renal neoplasms;clearcell renal carcinoma;prognosis.

　　XIAP是新近发现的一种凋亡抑制基因，在许多肿瘤组织中表达,而在正常组织中不表达。关于XIAP在肾透明细胞癌组织的表达及临床意义的研究,国内报道甚少。作者应用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RTPCR)及免疫组织化学技术检测肾透明细胞癌中XIAP的表达,探讨其在肾透明细胞癌组织中的表达及与病理分级、临床分期的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象

　　实验标本选自解放军总医院2003年至2005年70例手术所取肾透明细胞癌标本及10例相应远离肿瘤组织的正常肾组织标本，术中切除肾脏后立即取少量标本放入液氮中保存。所选病例临床资料完整，其中男46例，女24例，年龄30～68岁，平均(53.7±1.8)岁。病理分级G1级(高分化)34例，G2级(中分化)21例，G3级(低分化)15例;TNM分期T1N0M0 18例,T2N0M0 28例,T3N0M0 24例。所有的病理学指标均由病理科资深医生确定。10例非肿瘤肾脏标本(远离肿瘤5 cm以上)作为对照。

　　1.2 主要试剂

　　兔抗人XIAP多抗，R&D Systems,lnc.公司。常用缓冲液:二甲砷酸盐缓冲液(cacodylate buffer)pH 7.4,(MERCK公司);TrisNaCl缓冲液;3′，3二氨基联苯胺盐酸盐(3′，3diaminobenzidine，DAB)显色液(Amresco公司);柠檬酸(citric acid buffer,CB)缓冲液(MERCK公司)。实验所用βactin、XIAP的RTPCR引物，由北京奥科生物公司合成，XIAP引物序列为：5′GTGACTAGATGTCCACAAGG53′，5′GTTGAGGAGTGTCTGGTAAG3′,扩增片段长度为368 bp,βactin引物序列为：5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′，5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′,扩增片段长度为248 bp。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 总RNA提取和RTPCR

　　用Trozol(Gibco/BRL)一步法[1]提取冰冻组织的总RNA，紫外分光光度计(Genequant,80210902)测定RNA纯度，取0.5 μg总RNA用于反转录。反转录体系10 μL，包含1 μL 鼠白血病病毒逆转录酶和相应的缓冲液(50 mmol•L-1 TrisHCl,pH 8.3,75 mmol•L-1 KCl,3 mmol•L-1 MgCl2和10 mmol•L-1二硫苏糖醇)。1 μL cDNA 用于βactin、XIAP的PCR扩增，总体积25 μL，包含1 μL上、下游引物、0.25 μL TaqDNA聚合酶和相应的缓冲液(10 mmol•L-1 TrisHCl,pH 8.3,50 mmol•L-1 KCl,3 mmol•L-1 MgCl2)。XIAP的PCR循环参数为，94 ℃ 1min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30循环;βactin的PCR循环参数为94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、45 s,共30循环。

　　1.3.2 免疫组织化学染色

　　石蜡切片经二甲苯脱蜡后，梯度酒精依次水化至水。实验步骤按照免疫组织化学SP试剂盒(北京博美科生物技术公司)使用说明书进行，以微波柠檬酸盐进行抗原修复15 min，一抗4 ℃过夜(一抗稀释度为1100)，通用型生物素标记的二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。以TBS替代一抗做阴性对照。

　　1.3.3 结果判定标准

　　根据免疫组织化学染色的深度及阳性细胞的数量分别记0～3分，其中染色深度以多数细胞呈色反应为准。根据免疫组织化学染色的深度评分，0分：不着色;1分：浅棕黄色;2分：棕黄色;3分：深褐色。根据阳性细胞数量评分：0分：<10%;1分：10%～45%;2分：46%～65%;3分：>65%。染色的深度及阳性细胞数二者得分相乘，0分：阴性(-);1～2分：弱阳性(+);3～4分：阳性(+ +);5～6分：强阳性(+ + +)[2]。

　　1.3.4 统计学处理

　　采用STATA统计学软件进行数据分析，不同组间表达的结果处理用Kruskalwallis法秩和检验，取P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 XIAP在肾透明细胞癌及正常肾组织中的表达

　　利用RTPCR检测正常的肾组织中XIAP均无明显表达;70例肾透明细胞癌组织中XIAP基因高表达。免疫组织化学结果显示70例肾透明细胞癌标本中XIAP蛋白阳性表达共有52例，阳性率74.2%，XIAP主要表达于肾癌组织细胞质内，呈浅黄色至棕黄色弥漫分布。10例非肿瘤肾组织XIAP表达均为阴性。

　　2.2 XIAP的表达与肾透明细胞癌临床病理特征的关系

　　低、中分化肾癌组织中XIAP蛋白阳性表达率明显高于高分化组织(P<0.05)，低、中分化肾癌组织中XIAP蛋白阳性表达率分为93.3%和81.0%，差异有统计学意义(P<0.05);临床分期愈晚，XIAP蛋白阳性表达率愈高(P<0.05)。XIAP蛋白的表达与肾透明细胞癌的分级、分期有关(P<0.05)，见表1。表1 肾透明细胞癌患者XIAP蛋白表达与临床病理特征的关系(略)

　　3 讨论

　　肾癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全身肿瘤中占2%左右，男女比例约为21,高发年龄40～70岁;肾透明细胞癌是肾癌中最常见的类型，约占70%，其临床发展进程、生物学活性及预后各不相同，很难预料[34]。XIAP是新近发现的凋亡抑制蛋白家族的新成员，在细胞凋亡调控中起重要作用，研究发现XIAP表达于大多数肿瘤组织，而在正常组织中不表达，与肿瘤的进展、复发、预后及肿瘤化疗的耐药性密切相关[57]。国外研究报道XIAP mRNA高表达与肾细胞癌的临床分期与病理分级有关，肾透明细胞癌比乳头状肾细胞癌且有较高的XIAP表达预后差[8];XIAP的表达随肾肿瘤细胞分泌转化生长因子(transforming growth factorβ1，TGFβ1)的增多而增加[9];在非小细胞肺癌中XIAP也有同样的表达规律[10]。Ramp等[11]的报道结果显示，与高表达XIAP的肾癌患者比，无或低表达XIAP的肾癌患者有较长的生存期;XIAP与急性髓性白血病患者的存活时间之间也有很强的相关性，低表达XIAP的急性髓性白血病患者有更长的生存期[12];本研究结果显示，70例肾透明细胞癌标本中有52例XIAP蛋白阳性表达，阳性率74.2%，说明XIAP的表达与肾透明细胞癌的发生、发展有一定关联性;随着临床分期与病理分级的升高，XIAP蛋白的表达也逐渐增多，差异有显著意义;肾癌的临床分期与病理分级是影响其预后的重要因素，上述结果提示XIAP蛋白高表达的肾癌患者预后差，XIAP蛋白的表达有可能作为判断肾透明细胞癌预后的一个重要指标，也可以作为肾癌治疗的重要分子靶标，为靶向XIAP的抗肾细胞癌治疗提供理论依据。

　　【参考文献】

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