RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响

　　作者：张一兵　　作者单位：华北煤炭医学院生理学教研室，河北 唐山 063001

　　【摘要】目的： 研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响. 方法： 体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体，Lipofectamin 2000介导转染膀胱癌EJ细胞，采用RTPCR和Western Blot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果，转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变. 结果： EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达(P<0.05). 与对照组比较，细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1期阻滞，RNA干扰后,G1期细胞增加[(84.0±8.7)% vs (52.0±6.8)%, P<0.05]，S期细胞减少[(11.0±1.1)% vs (43.0±4.9)%, P<0.05]. 结论： EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.

　　【关键词】 膀胱肿瘤 EZH2基因 RNA干扰 细胞增殖 细胞周期

　　0引言

　　EZH2基因(enhancer of zest homolog 2, EZH2) 是多梳基因家族(polycomb group，PcG)的主要成员，与果蝇zeste基因增强子是同源基因. 在胚胎发育早期普遍存在，其高表达可促进细胞增殖，并参与肿瘤的发生发展[1]. 有研究[2]显示，EZH2基因在膀胱癌组织表达增加，与浸润转移密切相关，但作用机制还不明确. 本研究以EZH2基因为靶点,设计构建其短发夹状RNA的表达载体并转染膀胱癌EJ细胞，观察EZH2基因对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其作用机制，为膀胱癌基因治疗提供实验基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料人膀胱癌EJ细胞由天津泌尿外科研究所保存. Lipofectamine 2000，RNA提取纯化试剂TRIzol(美国Invitrogen公司); RTPCR试剂盒，质粒DNA提取试剂盒(北京博大泰克生物制品公司);抗人EZH2多克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1EZH2基因shRNA表达载体的构建根据文献[3]的方法，选择EZH2 mRNA的461~481 bp之间的核苷酸序列AAGACTCTGAATGCAGTTGCT为RNA干扰的靶序列，体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点，内含5′AAGACTCTGAATGCAGTTGCTTTCAAGAGAAGCAACTGCATTCAGAGTCTT3′发夹状序列的双链DNA,将合成的片段接入pRNAT载体,转染DH5α大肠杆菌，筛选、扩增，经测序证实构建成功，称之为EZH2shRNA;同时构建阴性表达质粒,称之为EZH2scrambled.

　　1.2.2重组质粒转染复苏的膀胱癌EJ细胞置事先加含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基的100 mm培养皿中，37℃， 50 mL/L CO2孵箱内培养，常规更换培养液、传代. 实验用细胞均使之处于状态良好的对数生长期. 转染前1 d按试验要求将所需密度的细胞接种6孔培养板，待细胞达到所需融合率时在无血清的DMEM环境中转染，操作步骤按Lipofectamin2000说明书进行. 实验分为：转染EZH2shRNA质粒为RNA干扰组;转染EZH2scrambled为阴性质粒组;未转染的EJ细胞为对照组.

　　1.2.3RTPCR检测EJ细胞EZH2基因mRNA表达转染后48 h后，收集各实验组EJ细胞约1×107，提取细胞总RNA. 取5 μg总RNA，加入1 μL由16个脱氧胸苷酸碱基组成的寡核苷酸Oligo(Dt)16，按说明书操作合成cDNA的第一链，然后进行PCR反应. GAPDH为内参照. 引物的序列为EZH2(289 bp):上游：5′GTG GAG AGA TTA TTT CTC AAG ATG3′，下游：5′CCG ACA TAC TTC AGG GCA TCA GCC3′; GAPDH引物(492 bp):上游:5′TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG3′，下游：5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′, 反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min. 各取10 μL反应产物，12 g/L琼脂糖凝胶电泳，Image Master Total Lab软件进行条带分析，以EZH2与GAPDH条带的积分吸光度比值表示EZH2 mRNA的表达变化.

　　1.2.4Western Blot检测EJ细胞EZH2基因蛋白表达抗体为1∶1000稀释的EZH2抗兔人多克隆抗体，二抗为1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔多克隆抗体，DAB显色. SDSPAGE电泳、转膜采用常规方法，βactin作为内参照. 检测EZH2蛋白和βactin蛋白在各组表达条带的灰度值，两者灰度值的比值(EZH2/βactin)反映EZH2蛋白的表达变化.

　　1.2.5MTT法检测EJ细胞增殖细胞以 5×103/100 μL接种96孔细胞板培养，待细胞融合率达50%～70%时,分别转染EZH2shRNA， EZH2scrambled质粒, 同时设对照组和只加培养基的调零组，每组3个复孔. 转染后24，48，72，96和120 h时每孔加入5 g/L的MTT 15 μL，37℃，50 mL/L CO2孵箱敷育4 h，吸取上清后，每孔加入DMSO 150 μL，室温下振荡10 min，酶标仪波长490 nm检测各孔A值，不同时间点依次检测，实验结果取3个复孔的平均值，绘制细胞生长曲线，肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%.

　　1.2.6流式细胞仪检测细胞周期转染EZH2shRNA的细胞和正常EJ细胞胰蛋白酶消化并收集细胞, 1000 r/min 离心10 min,收集细胞沉淀;PBS洗2次,用预冷的700 mL/L乙醇,-20℃过夜,以PBS洗脱乙醇,加入PI染色液1 mL,室温30 min,上流式细胞仪检测细胞周期变化,实验设3个复孔.

　　统计学处理: 采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1重组质粒鉴定重组质粒经双酶切鉴定，可见有大于6000 bp的长片段和小于100 bp的短片段，提取质粒上海康成公司测序，结果完全正确，干扰载体构建成功(图1).

　　M： PCR标准分子质量; 1～2: 重组质粒.

　　图1重组质粒双酶切的电泳结果(略)

　　2.2EJ细胞EZH2基因mRNA表达RTPCR产物电泳结果显示RNA干扰组细胞EZH2基因mRNA表达明显降低. EZH2 mRNA与GAPDH mRNA灰度比值分别为：对照组：0.486±0.070;阴性质粒组：0.273±0.050;RNA干扰组：0.023±0.003. RNA干扰组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而阴性质粒组与对照组比较无明显差异(P>0.05, 图2).

　　2.3EJ细胞EZH2基因蛋白表达Western Blot结果显示EZH2蛋白与βactin蛋白灰度比值分别是：对照组：0.499±0.097;阴性质粒组：0.381±0.050;RNA干扰组：0.109±0.004. RNA干扰组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性质粒组与对照组比较无明显差异(P>0.05，图3).

　　M： PCR标准分子质量; 1： 对照组; 2: RNA干扰组; 3: 阴性质粒组.

　　图2EZH2 mRNA在实验各组表达(略)

　　1： RNA干扰组; 2: 阴性质粒组; 3: 对照组.

　　图3EZH2蛋白在实验各组表达(略)

　　2.4MTT法比较EJ细胞增殖活性细胞增殖曲线显示，与对照组比较，RNA干扰组的EJ细胞其增殖速度明显降低，转染后24，48，72，96和120 h，细胞生长抑制率分别为43.9%，59.1%，49%，45.5%和45.2%，以转染后48 h最高，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而阴性质粒组细胞生长变化与对照组比较无明显差异(P>0.05，图4).

　　图4MTT方法检测细胞增殖情况(略)

　　2.5流式细胞仪检测RNA干扰组G1期细胞为(84.0±8.7)%，S期细胞为(11.0±1.1)%，而对照组G1期细胞为(52.0±6.8)%，S期细胞为(43.0±4.9)%，两者相比较差异均有统计学意义(P<0.05，图5 ).

　　3讨论

　　肿瘤细胞的异常增殖与肿瘤的侵袭和转移密切相关，这一病理过程涉及许多基因的参与. EZH2基因是新发现的癌基因，在胚胎发育早期普遍存在，是维持细胞增殖所必需的，研究发现EZH2基因高表达的肿瘤组织增殖能力加强并与肿瘤侵袭转移密切相关[4-5]，因此，作为一个新的分子标志物引起研究者的广泛关注. 本研究我们发现，靶向EZH2基因shRNA转染膀胱癌EJ细胞后，细胞的增殖能力明显下降，提示EZH2基因可能是膀胱癌基因治疗的一个新靶点. EZH2是一种转录抑制因子，其编码蛋白含有高度保守的SET结构域，该结构域具有甲基转移酶的活性，通过甲基化作用抑制下游基因的表达，其中大多为抑癌基因，结果导致在肿瘤侵袭转移过程中促进肿瘤转移和抑制肿瘤转移基因间的相互作用倾向于前者，促进了肿瘤的增殖和转移[6-7].

　　A： RNA干扰组; B： 对照组.

　　图5RNA干扰组和对照组细胞周期分布(略)

　　细胞周期调控异常是恶性肿瘤增殖异常的主要原因，肿瘤是多基因疾病，许多基因直接或间接参与细胞周期调控，这些基因的突变或表达异常可以引起细胞周期的失控，使肿瘤细胞获得以细胞增殖为主的失控性生长特征[8]. 有研究证实EZH2基因高表达可以抑制一些细胞周期相关基因的表达，促进细胞进入S期和G2M期转换[3]. 我们的研究也证实靶向EZH2基因shRNA表达载体转染膀胱癌EJ细胞后，进入G1期的EJ细胞明显增多，进入S期的细胞明显减少，EJ细胞出现G1期阻滞. 这表明通过RNA干扰下调EZH2基因表达后，抑制了肿瘤细胞恶性增殖信号转导，阻滞细胞周期进展，使细胞增殖能力下降. MTT检测显示在转染后48 h细胞增殖抑制率最高，我们推测一方面EZH2的表达是否有细胞周期依赖性，另一方面是否shRNA载体的表达有时相性.

　　综上所述，EZH2与肿瘤的发生、发展密切相关，而EZH2基因shRNA表达载体可以阻止细胞周期进展，抑制肿瘤细胞增殖，因此采用RNAi来抑制EZH2基因的表达，阻止肿瘤的生长，可能是肿瘤基因治疗的有效途径，但如何高效的将shRNA转染到肿瘤细胞以及提高shRNA的器官靶向特异性是RNA干扰临床应用所必须解决的问题.

　　【参考文献】

　　[1] Bachmann IM, Halvorsen OJ, Collett K, et al. EZH2 expression is associated with high proliferation rate and aggressive tumor subgroups in cutaneous melanoma and cancers of the endometrium, prostate, and breast[J]. J Clin Oncol, 2006, 24(2):268-273.

　　[2] 张一兵,牛海涛,畅继武. EZH2基因在膀胱移行细胞癌组织的表达及其临床意义[J]. 中国综合临床,2008,24(3):193-195.

　　[3] Bracken AP, Pasini D, Capra M, et al. EZH2 is downstream of the pRBE2F pathway, essential for proliferation and amplified in cancer[J]. EMBO J, 2003,22(20):5323-5333.

　　[4] 宋力,崔小健,苏大军,等. 前列腺癌组织EZH2基因的表达及其意义[J]. 第四军医大学学报, 2006,13：1193-1195.

　　[5] Collett K, Eide GE, Arnes J, et al. Expression of enhancer of zeste homologue 2 is significantly associated with increased tumor cell proliferation and is a marker of aggressive breast cancer[J]. Clin Cancer Res,2006,12(4):1168-1174.

　　[6] Vire E, Brenner C, Deplus R, et al. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation [J]. Nature,2006,439:871-874.

　　[7] Zetter BR, Banyard J. The silence of the genes[J]. Nature, 2002,419(6907):572-573.

　　[8] Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. The cell cycle: A review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer[J]. Cell Prolif, 2003,36(3):131-149.