人端粒酶逆转录酶在膀胱肿瘤中的表达及其与预后的关系
发表时间：2012-05-11 浏览次数：645次
作者：余沁楠,张会清,李建昌 作者单位：新乡医学院第一附属医院泌尿外科, 河南 卫辉 453100
【摘要】目的 检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)在膀胱肿瘤中的定量表达，探讨hTERT与膀胱肿瘤预后复发的关系。方法 采用免疫组织化学法和高清晰彩色医学图文分析系统，对45例膀胱移行细胞癌(BTCC)组织标本中的hTERT的表达情况进行定量检测，并用13例正常膀胱组织标本作为对照。结果 BTCC组织标本中均可见有hTERT的表达，正常膀胱组织中无表达。hTERT的表达强度与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、部位以及肿瘤的单多发等情况无关(P>0.05)，而与肿瘤复发有关(P<0.05)。结论 hTERT在膀胱肿瘤中表达上调，其活性与预后相关，可以作为检测肿瘤复发的指标。
【关键词】 人端粒酶逆转录酶,膀胱肿瘤,免疫组织化学
Abstract: Objective To detect the quantitative expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT)in bladder neoplasm, and to investigate the correlation between hTERT and prognosis.Methods The quantitative expression of hTERT was detected in 45 cases of bladder transitional cell carcinoma ( BTCC ) tissues and 13 cases of human normal bladder mucosa tissues (control group) with immunohistochemistry method and HMIAS2000 image analysis system.Results The expression of hTERT in 45 cases of BTCC tissues was positive and in 13 cases of human normal bladder mucosa tissues was negative. The expression of hTERT was uncorrelated with the sex and age of patients, the size and position of tumor, single and multiple tumor(P>0.05),but it was correlated with recurrence of BTCC(P<0.05).Conclusion The upregulated expression of hTERT in BTCC suggests that, it is correlated with the prognosis and can be regarded as a marker for the recurrence.
Key words: human telomerase reverse transcriptase;bladder neoplasm;immunohistochemistry
膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤，寻求一种可预测复发和预后的标记物是治疗膀胱肿瘤的关键。研究发现，90%以上的膀胱肿瘤组织中均可检测到人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的活性表达[1]。本研究拟采用免疫组织化学方法检测hTERT在膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)中的表达，利用图像分析处理系统对免疫组织化学结果进行定量分析，进一步探讨了hTERT的活性表达与膀胱肿瘤的预后等生物学特性之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集膀胱肿瘤石蜡标本45例，男35例，女10例;年龄35～93岁，平均年龄63岁;病理分级按WHO标准[2]：Ⅰ级15例，Ⅱ级18例，Ⅲ级12例;临床分期按TNM标准[2]：Tis期2例，T1期16例，T2期12例，T3期8例，T4期7例;原发性32例，复发性13例(随访2～3 a，≤12月复发者为6例，>12月复发者为7例)。另取13例正常膀胱粘膜组织为对照。
1.2 实验方法
1.2.1 标本处理
手术切除的病变组织，取材后经体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋。连续4 μm切片，HE染色复核。
1.2.2 免疫组织化学染色
一抗hTERT为浓缩液，其浓度稀释至1100再行滴加，用PBS替代一抗作阴性对照。全部病例均采用Envision法。
1.3 结果判定
(1)hTERT染色以细胞核或细胞浆染色为棕黄色为阳性，每例标本选取10个不相重叠的具有代表性的高倍视野(10×40)，并将图像输入高清晰彩色医学图文分析系统，进行图像定量分析，测定平均灰度值(average gray value，AG)和面数密度值(numerical density on area，NA，个/100 μm2);(2) 根据每个视野的平均灰度值计算出每例的平均灰度值，以平均灰度值反映hTERT的表达强度，平均灰度与细胞内物质含量、免疫组织化学的染色强度成反比;(3) 以相同的方法得出NA值，NA值与细胞内物质含量、免疫组织化学表达强度成正比。
1.4 统计学处理
实验数据计数资料采用均数±标准差(±s)表达，应用t检验和单因素方差分析进行统计学处理，以α=0.05(双侧)为检验水准，P<0.05表示差异具有统计学意义，统计软件应用SPSS 10.0统计软件包。
2 结果
2.1 膀胱肿瘤组织中hTERT表达的定位与分布
hTERT阳性染色主要定位于肿瘤细胞的胞核内，呈棕黄色细颗粒状，其阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布，偶有少数病例可见细胞浆染色。45例BTCC中均可见hTERT的阳性表达，而13例正常膀胱黏膜组织中hTERT均呈阴性表达，两者比较差异有显著性(P<0.001)，见表1。表1 hTERT在BTCC、正常膀胱组织的平均灰度和面数密度的比较(略)
2.2 hTERT的表达强度与临床特征的关系
hTERT的表达强度与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、部位以及肿瘤的单多发等情况无关(P>0.05)，见表2。表2 hTERT的表达与膀胱肿瘤临床特征的关系(略)
2.3 hTERT的表达与膀胱肿瘤复发的关系
32例原发性和13例复发性膀胱移行细胞癌的平均灰度值和面数密度相比较均具有显著差异(P<0.05);复发时间≤12月的6例和复发时间>12月的7例BTCC的平均灰度和面数密度相比较均具有显著差异(P分别<0.001和<0.05)，见表3。表3 hTERT的表达与膀胱肿瘤复发的关系(略)
3 讨论
膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤，占全部恶性肿瘤的3.2%，其中尿路上皮肿瘤占95%以上[3]。膀胱肿瘤多数为移行上皮细胞癌，浅表性癌复发率较高，且10%～30%[4]的复发性癌随着复发次数的增多，其恶性程度也逐渐增高，且可转变为浸润性和(或)转移性癌，一旦癌肿侵及深肌层，大部分患者预后不佳，早期发现和严密随访是成功治疗膀胱肿瘤的重要条件。为此，寻求一种可预测复发和预后的标记物是治疗膀胱肿瘤的关键。
目前膀胱镜检查及可疑病变处活检仍是膀胱肿瘤诊断和随访的金标准[5]。然而，活检区域的局限性导致难以发现微小及隐匿性病变，降低了它的灵敏度，并且膀胱镜检查属侵入性检查，患者有一定痛苦，还可能会导致尿路感染，不适宜用于肿瘤的筛选和普查，这使膀胱镜检查在膀胱肿瘤的早期诊断及临床应用受到一定的限制。尿细胞学检查是非侵入性检查，能直接识别尿中脱落的肿瘤细胞，它对诊断膀胱肿瘤的特异性很高，但早期肿瘤的假阴性率较高，敏感性较低，尤其对低分化肿瘤的敏感性仅为20%～40%，容易发生漏诊[6]。理想的早期诊断和检测膀胱癌的方法应该是客观的、非侵入性的、具有高敏感性和特异性，尤其应该能识别低级别的肿瘤[7]。
自从1978年Blackburn[8]首次从嗜热四膜虫中分离出DNA末端的一段富含G的重复序列并命名为端粒后，对端粒、端粒酶以及端粒酶逆转录酶的研究越来越深入，很多学者在消化系统、呼吸系统、神经系统等诸多领域对端粒酶和hTERT进行了研究，均得出肿瘤组织中端粒酶和hTERT高表达的结论。同样在泌尿系统中，国内外的报道表明，膀胱肿瘤组织中存在有hTERT的高表达。正常人的体细胞内无hTERT的表达，90%以上的恶性肿瘤细胞存在hTERT的高表达，hTERT为端粒酶的重要组成成分之一[9]，hTERT表达上调催化激活端粒酶是肿瘤形成的关键步骤[1,1011]。如果hTERT的表达下调或受到抑制，将会导致端粒缩短，染色体不稳定，抑制细胞增殖，加速细胞凋亡以及改变癌细胞的表型[12]。因此，检测hTERT活性具有较高的特异性和灵敏度[13]。且目前国内外对hTERT的研究都是在定性上进行，未能从定量的角度来加以说明。
本研究所采用的平均灰度和面数密度均属于图像分析中的灰度参数，用来表示被测细胞或细胞核颜色的深浅程度(浓度信息)。利用这种分析可将被测目标数字化，具有定量的意义，为图像的观察、对比、统计提供了客观数据。利用测量细胞或细胞某一部分的平均灰度可定量得到组织内某种成分的含量。平均灰度值与免疫组织化学染色的强弱、组织细胞内被测物质的含量或活性成反比关系，平均灰度值越高，说明其免疫组织化学染色越浅，被测物质的含量或活性越低，反之越高。而面数密度是指参照系截面的单位面积内含某种颗粒截面的数目，与组织细胞内被测物质的含量或活性成正比关系，面数密度值越高表明阳性目标面积越大，单位面积内相应的阳性细胞数越多，被测物质的含量或活性越高，反之越低。
王新生等[14]用免疫组织化学方法测定了72例膀胱肿瘤组织中hTERT的表达情况，研究表明hTERT表达强度与肿瘤的预后密切相关，hTERT的表达强度越高则膀胱肿瘤的复发率也越高，二者呈正相关。结合本研究结果可推断有复发倾向病例的hTERT表达比没有复发倾向的病例高，hTERT的表达强度随着肿瘤的复发而增高，且hTERT的表达越强，肿瘤越容易复发且复发周期越短，反之复发周期较长，说明hTERT的异常表达及其表达的强弱可作为判断膀胱肿瘤是否易复发的指标。
【参考文献】
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