构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究

　　作者：王静，郭立国，冯金升，任红茹 作者单位：中国航天员科研训练中心，北京

　　【摘要】 探索神经生长因子诱导的交感神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌组织神经支配研究模型的可行性。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与NGF诱导的交感神经元样PC12细胞在液态的Ι型胶原中共培养，通过光学显微镜观察、常规H.E.染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对其进行评价。在三维共培养模型中，NGF诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起，突起及其上的膨体能够到达跳动的心肌细胞表面，神经突起随心肌细胞一起跳动。说明采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的，神经细胞与心肌细胞可能有支配关系。

　　【关键词】 组织工程,心肌细胞,PC12细胞,共培养,神经支配,神经生长因子

　　Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cells being used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes isolated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were cocultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model.

　　Key words：Tissue engineering,Cardiomyocytes,PC12,Co-culture,Innervation,Nerve growth factor

　　1 引 言

　　神经系统对机体各组织、器官及系统的发生、发育过程具有重要作用。神经系统使机体各部分在功能上成为整体。近年来，组织工程研究发展迅速，国内外研究人员相继成功地体外复制了软骨[1]、骨[2]、皮肤[3]以及心肌[4]等组织。但是，要保证组织工程化产品在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。如何在构建工程化组织的同时重建其血液供应和神经支配，已成为组织工程研究从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。到目前为止，工程化心肌组织的血管化[5]研究进展顺利，而其神经支配研究由于神经系统的复杂性及缺乏合适的体外模型，目前尚未见报道。

　　心肌和其他肌肉组织一样，神经的有效支配在其发挥正常生理功能方面起着重要作用。Dianne[6]等(1991年)将胸腰部交感神经节和心肌细胞共培养，发现具有肾上腺素能支配的心肌细胞的体积明显增大，表明神经支配有利于心肌细胞的生长。李振中[7]等(1996年)将大鼠脊神经节与心肌细胞联合培养，发现神经纤维终止于搏动的心肌细胞表面。上述通过二维条件下，心肌细胞与神经细胞共培养的结果表明，神经细胞与心肌细胞共培养能够相互影响，并有利于心肌细胞的生长发育和功能的发挥。

　　由于原代分离培养的交感神经元对体外生存环境要求较高，而NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞培养条件更为简单，培养过程中状态也相对稳定。工程化心肌组织的培养环境主要涉及到心肌组织的生长与存活，因此很难同时满足原代分离神经元的生长要求。基于此，本研究选用NGF诱导分化的PC12细胞与心肌细胞在液态胶原中共培养作为模型，对构建具有神经支配的工程化心肌组织进行了初步的探索性研究，以探讨体外再造具有神经支配的心肌组织工程的可行性，并为心肌组织工程的神经支配研究提供初步的资料。

　　2 材料与方法

　　2.1 材料

　　2.1.1 PC12细胞 由军事医学科学院三所一室朱玲玲教授惠赠

　　2.1.2 NGF 由军事医学科学院三所八室赵强实验师惠赠

　　2.1.3 动物 新生Wistar大鼠(1—2日龄)，由军事医学科学院动物中心提供。

　　2.1.4 仪器及装置 相差显微镜，二氧化碳培养箱，透射电镜等。

　　2.1.5 试剂 DMEM (Sigma) , 胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所) ,胰酶(Sigma) ,基质蛋白(Matrigel , Sigma) , cTnT抗体(武汉博士德公司,1∶500) ，生物素标记的羊抗小鼠试剂盒(中山试剂公司) ,DAB 显色试剂盒(中山试剂公司)，NGF(神经生长因子)等。

　　2.2 方法

　　2.2.1 心肌细胞的分离[8] 取新生大鼠心室肌组织，充分剪碎后用0.25%的胰酶消化的方法获得单细胞悬液，在含有15%胎牛血清的DMEM培养液中差速贴壁1 h取上清离心，以去除成纤维细胞。收集未贴壁细胞，其中主要为心肌细胞。

　　2.2.2 PC12细胞的培养 PC12细胞按常规复苏，以5×105/ml的浓度接种于25 ml培养瓶中，培养液为PC12细胞生长培养基，置于37℃孵箱内培养。24 h后加入NGF，浓度为50 ng/ml,隔天换液一次。

　　2.2.3 Ⅰ型胶原的制备[9] 从大鼠尾根部切断鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30 min，无菌条件下撕下尾腱，剪碎。取尾腱碎片浸入于0.1%的醋酸中，置4 ℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌。48 h后离心收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液中所含的胶原浓度约为3.0 mg/ml。

　　2.2.4 PC12细胞与大鼠心肌细胞在液态胶原中的混合培养 液态Ⅰ型胶原(3.0mg/ml)与2×DMEM(添加20%胎牛血清，)等比例混合，用0.1 mol/L NaOH调为中性，再加入占上述混合液体积总量10%的Matrigel。将分离的新生大鼠心肌细胞(浓度为3×106/ml)与PC12细胞(浓度为3×104/ml)与上述混合物混合，加入12孔板中，置5% CO2、37 ℃培养箱中，心肌细胞/PC12细胞/胶原混合液即可在槽中凝固成片状的心肌细胞/PC12细胞/胶原复合物。60 min后加入培养液及NGF50 ng/ml。

　　2.2.5 检测方法 14天后取材固定，显微镜下观察、HE染色与免疫组化及透射电镜检查。(1) 显微镜下观察:主要观察混合培养的细胞在体外培养期间情况,观察指标包括：心肌细胞跳动的部位、强度、频率及一致性等;神经细胞神经突起的生长情况;神经细胞与心肌细胞的连接情况，以及有没有神经纤维终止于搏动的心肌细胞表面等。(2) HE染色:取心肌细胞/胶原复合物片层，用4 %的多聚甲醛溶液固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切成4 μm 的切片。HE染色,光镜观察。(3)免疫组化染色:将石蜡切片分别放入二甲苯、酒精中脱蜡，加一抗，4 ℃冰箱中过夜,加二抗，加入呈色液(DAB)显色，显微镜下观察，阳性部位显棕色，阴性不显色，苏木素核复染，封片。(4) 透射电镜观察：标本用3%的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片，透射电镜观察。

　　3结 果

　　3.1 相差显微镜下观察的结果

　　相差显微镜下观察，第二天即可见单个的神经细胞长出突起，随着时间的延长，长出突起的细胞越来越多，突起也越来越长，在心肌细胞的表面延伸(见图1A)。心肌细胞在培养的第二天即可见单个细胞在跳动，第三天即可见一簇一簇的细胞在跳动，第五天神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动(见图1B)。图1 PC12与心肌细胞在液态胶原中混合培养的相差显微

　　镜下观察的结果

　　A.神经细胞长出的神经突起(↑)分别到达心肌细胞

　　(▲)的表面(×40)

　　B.神经细胞长出的神经突起(↑)呈放射状到达心肌

　　细胞的表面并随心肌细胞一起跳动(×40)

　　Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated

　　tissue-engineered cardiac sheet(×40)

　　3.2 HE染色结果

　　由于本实验采用低密度的PC12细胞植入，因此PC12细胞分散在原代心肌细胞的网络中。PC12细胞的核较大，而心肌细胞的核较小，核均为蓝色(见图2)。

　　3.3 免疫组化染色结果

　　采用a-肌小节肌动蛋白免疫组化染色对心肌细胞进行鉴定，胞浆呈棕色(见图3A)。采用NF对神经纤维进行免疫组化染色(见图3B)，可观察到NF阳性的细胞胞核较大，其周围有一些染色阴性的心肌细胞，胞核较小。

　　3.4 透射电镜观察结果

　　PC12细胞与新生大鼠心肌细胞在液态胶原中混合培养后，图中可见心肌细胞、心肌纤维和神经突起。N1、N2 为神经纤维，C为心肌细胞(见图4)。M为心肌纤维(见图5)，S为PC12与心肌细胞之间的突触(见图6)。

　　4 讨 论

　　本研究以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠心肌细胞共培养和体外构建组织工程化心肌片层的研究为基础，以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠新室肌细胞为种子细胞，以胶原、Matrigel为支架材料，进行构建具有神经支配的工程化心肌片层的初步探索性研究。通过组织学、免疫组化的检测与透射电镜的观察，发现PC12细胞在三维条件下，经NGF诱导产生较长的神经突起;PC12细胞与心肌细胞在三维条件下共培养，神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面与心肌细胞一起跳动，且长出的神经突起能与原代心肌细胞形成形态上非常疑似突触连接的结构。

　　由于各组织与器官中神经系统的复杂性，到目前为止，组织工程化产品的神经支配研究进展相对比较缓慢，仅在骨组织工程的神经支配研究中取得部分进展，张元平等[10](2005)将感觉神经、运动神经分别植入组织工程骨修复兔股骨缺损，与单纯组织工程骨和组织工程骨中植入血管束的修复效果相比较，发现利用感觉神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用,而植入运动神经束却无此作用。这项研究为组织工程骨的神经化重建奠定了一定的基础。而其它组织工程化产品的神经支配研究则未见报道。

　　近年来组织工程研究领域发展迅速，心肌组织工程研究也取得了很大的进展，国内外有关心肌组织构建物的报道日益增多，德国科学家Zimmermann 等人[11](2002年)成功在体外构建了组织工程心肌条带，军事医学科学院赵云山博士等[12](2004年)在Zimmermann研究基础上，构建出类似天然心肌的心肌条带，并对细胞接种浓度及胶原凝胶含量与再造条件的关系进行了深入研究。上述体外培养的可供移植的环状条带给治疗心脏疾患带来了新的希望。但是，要保证工程化心肌组织在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。

　　随着心肌组织工程研究深入，以及向临床过渡的逐渐展开，一个主要的问题就是如何使构建的工程化心肌组织在体内存活并迅速发挥作用。带有血管系统和神经支配的复合工程化心肌组织符合仿生学观点，是理想的解决方案。关于心肌组织血液供应的形式已有较广泛的研究，比如, 国内外一些实验室应用混合细胞构建工程化组织的技术方法，观察不同细胞间的相互作用对血管形成的影响, 尝试进行工程组织体外人工血管化，使移植后的组织尽快与宿主之间建立血液循环。Zimmermann等[13](2003)发现，在缺血模型中，利用混有其它细胞的心肌细胞构建的工程化心肌组织的心肌收缩力比单纯由心肌细胞构建的强两倍。不仅如此，Zimmermann等[14](2002)还观察到，混合细胞构建的工程化心肌组织，同时出现了初级毛细血管和大血管样结构。这些血管样结构在移植后较快与宿主建立了血液循环。

　　在心肌组织的神经支配方面，由于心肌的神经支配比较复杂，且没有合适的体外研究模型。因此，一方面要对心脏神经的解剖学、形态学、生理学做进一步的研究，另一方面应对心肌组织工程神经支配的方式进行必要的探索，以便加快心肌组织工程向临床的应用。虽然近年来心肌组织工程血管化研究发展迅速，但是，到目前为止，心肌组织工程的神经支配研究尚未见报道。本研究是在以往研究的基础上，首次对工程化心肌组织的神经支配进行探索性研究。

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