前列腺癌组织中SOD2的cDNA克隆及其序列分析

　　作者：王明臣,王好东,张善锋,王红钢,臧明玺　　作者单位：郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450052

　　【摘要】目的构建前列腺癌组织中SOD2的cDNA克隆，并进行序列分析。方法 从人前列腺癌组织细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA, PCR扩增 cDNA片段, 将cDNA克隆入载体pGEMT中构建TA克隆, 对阳性克隆进行序列测定分析。结果 在1例前列腺癌组织标本中发现了SOD2基因的两个相连的点突变位点：372nt T→G颠换和373nt G→T颠换。蛋白序列比较分析显示：对应SOD2编码蛋白的第89位氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。结论 SOD2基因突变在前列腺癌的发生中可能起重要作用。

　　【关键词】 锰超氧化物歧化酶;逆转录聚合酶链反应;分子克隆;序列测定

　　cDNA cloning and sequence analysis of superoxide dismutase 2 in prostate cancer tissues

　　WANG MingChen, WANG HaoDong，ZHANG ShanFeng，et al.

　　Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medicine，Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan, China

　　【Abstract】 Objective To construct the cDNA clone of superoxide dismutase 2 (SOD2) in prostate cancer tissues and analyze the sequence. Methods Total RNA was extracted from prostate cancer tissues, and then was reversely transcripted to cDNA. The cDNA of SOD2 gene was amplified with PCR method and inserted into pGEMT vector to construct TA clone, and then the DNA sequence of positive clone was performed. Results Two consecutive mutation sites of SOD2 gene were found in one prostate carcinoma specimen: the transversion of 372nt T→G and 373nt G→T. The comparative analysis of corresponding protein sequence indicated that the leucine at 89 site was replaced by arginine.Conclusions The SOD2 gene mutation may play an important role in the pathogenesis of prostate cancer.

　　【Key words】 Manganesecontaining superoxide dismutase; RTPCR; Molecular cloning; Sequence analysis

　　前列腺癌发生的确切分子机制尚未阐明。研究表明, 活性氧(ROS)参与肿瘤的启动和促进过程〔1〕。超氧化物歧化酶2(SOD2)基因编码含锰超氧化物歧化酶 (MnSOD)，是体内主要的超氧阴离子自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。近年研究发现, SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降, 提示SOD2基因系潜在的新型肿瘤抑制基因〔2，3〕。本研究采用RTPCR技术，构建人前列腺癌组织SOD2基因的cDNA克隆并进行序列测定，期望揭示前列腺癌的发生是否与SOD2基因的突变及异常表达有本质联系。

　　1 材料与方法

　　1.1 样本的采集与处理 收集2003年～2005年间7例前列腺癌患者手术后的肿瘤组织样本及20例良性前列腺增生患者的组织样本(样本来源于平顶山煤业集团总医院，郑州大学一、二附院, 河南大学二附院)。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。所有病人术前均未行化疗。

　　1.2 SOD2引物设计与合成 SOD2扩增上游引物：5′CAACGCGCAGATCATGCAGC3′(130～149);下游引物：5′GGCCTGTTGTTCCTTGCAGT3′(530～511)。由上海生工公司合成，经PAGE纯化。

　　1.3 TA克隆通用鉴定引物 SP6：5′CATACGATTTAGGTGACACTATAG3′(2 845～2 867 bp);T7：5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′(85～63 bp)。由上海生工公司合成，经PAGE纯化。

　　1.4 cDNA的合成 应用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取RNA。采用的逆转录反应体系：5×RT缓冲液6 μl，10 mmol/L 4×dNTP 2 μl，通用引物1 μl，RNasin 40 U, AMV 5 U,提取总RNA 5 μl , DEPC水补足30 μl，42℃水浴逆转录1 h。

　　1.5 PCR 扩增 人SOD2 的cDNA 扩增反应体系：逆转录所得cDNA 5 μl, SOD2上、下游引物各0.5 μl，10×缓冲液3 μl，10 mmol/L 4×dNTP 2 μl，Taq酶 0.5 μl，去离子水补足30 μl。94℃预变性5 min，94℃变性 50 s，55℃复性50 s，72℃延伸60 s，循环30次，72℃末端延伸5 min。

　　1.6 PCR扩增产物的纯化 使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，用德国Qiagen公司胶回收试剂盒回收纯化。

　　1.7 SOD2基因的克隆 PCR产物纯化后与pGEMT载体(购自Promega公司)连接。按照常规氯化钙法转化JM109(为本室保存)，蓝白筛选出阳性菌落, 并进行PCR扩增鉴定, 转板培养。

　　1.8 SOD2重组克隆的序列测定 将提取的质粒用双脱氧终止法PCR扩增并进行扩增产物的纯化，向反应体系中加入75%异丙醇80 μl沉淀DNA，室温放置15 min，12 000 r/min 离心20 min，小心移去上清，样品开口置90℃ 1 min,加入25 μl TSR 95℃水浴5 min, 全部液体转入测序管，上机测序，使用PE 377型DNA序列分析仪。

　　2 结 果

　　2.1 SOD2基因的RTPCR扩增结果 扩增片段的大小约为400 bp, 与预期大小一致。

　　2.2 重组克隆pGEMTSOD2的筛选与鉴定 ，由于pGEMT载体多克隆位点两侧分别存在T7和SP6启动子序列，因此可以用T7和SP6为引物对载体pGEMT的多克隆位点是否插入外源基因进行PCR扩增筛选鉴定。阳性重组子pGEMTSOD2扩增产物为576 bp(T7和SP6间原有序列长度为176 bp)。

　　2.3 pGEMTSOD2阳性克隆的测序及分析结果 ，从阳性重组子中提取质粒DNA，利用荧光标记法ABl377测序仪测序。本研究对7例前列腺癌组织及20例良性前列腺增生组织的SOD2克隆测序分析结果显示, 在1例前列腺癌组织标本中发现了SOD2基因的两个相连的点突变位点：372nt T→G颠换和373nt G→T颠换。蛋白序列比较分析显示, 对应SOD2编码的蛋白的89位氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。其余标本组织未发现基因序列异常。

　　3 讨 论

　　SOD作为体内以O2为唯一底物的天然酶类清除剂和自由基连锁反应的阻断剂，在保护细胞免受ROS的氧毒性损伤中发挥最重要作用。真核生物中主要含有CuZnSOD和MnSOD两种同工酶。SOD2基因编码MnSOD,系存在于真核细胞线粒体基质中的一种抗氧化酶。线粒体氧化呼吸链电子传递过程是体内活性氧自由基产生的最主要途径, MnSOD可首先清除这些自由基以防止自由基的累积和扩散, 因此MnSOD基因的表达和调控对机体内自由基清除的平衡体系至关重要。ROS还作为机体重要的信号分子，参与调控细胞的分化、增殖和凋亡等一系列生命活动, 与肿瘤的发生密切相关〔4〕。研究认为MnSOD是一种新的肿瘤抑制因子〔2〕，MnSOD的基因表达与肿瘤的分化程度和恶性表型相关。

　　MnSOD与前列腺癌发生的关系密切。有报道显示与正常和良性前列腺增生组织相比，前列腺癌组织中MnSOD的表达显著降低〔5〕。MnSOD能通过延长细胞生长周期而抑制肿瘤细胞生长。用质粒将MnSOD基因转入前列腺癌细胞中，结果MnSOD蛋白量增加7～8倍,　同时癌细胞增生周期大幅度延长〔6〕。本研究对前列腺癌和良性前列腺增生组织中SOD2基因的克隆测序分析，发现1例前列腺癌组织存在SOD2基因的两个相连的点突变(372 nt T→G颠换和373 nt G→T颠换)，且均为有意义突变，结果导致MnSOD编码蛋白的第89位氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。提示在前列腺癌发生中, 可能由于MnSOD表达低下与基因突变导致相应功能蛋白减少或缺陷，引发MnSOD清除体内氧自由基的能力下降，造成活性氧自由基净水平的增加，后者可造成DNA的氧化性损伤，最终导致肿瘤的发生。鉴于此，可据已知的正常SOD2基因序列人工合成SOD2或SOD2模拟物，然后用载体将它转入到人前列腺癌细胞中，以替代突变的SOD2，而抗氧化和抑制肿瘤细胞生长。

　　【参考文献】

　　1 Valko M，Rhodes CJ，Moncol J,et al.Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stressinduced cancer〔J〕. Chem Biol Interact, 2006;160(1):140.

　　2 Kang D, Lee KM, Park SK,et al.Functional variant of manganese superoxide dismutase polymorphism is associated with prostate cancer risk in the prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer study〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007;16(8):15816.

　　3 Bostwick DG, Alexander EE, Singh R,et al.Antioxidant enzyme expression and reactive oxygen species damage in prostatic intraepithelial neoplasia and cancer〔J〕.Cancer, 2000;89(1):12334.

　　4 Sauer H, Wartenberg M, Hescheler J. Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation〔J〕. Cell Physiol Biochem,2001;11(4):17386.

　　5 王明臣,郭茂锋,赵国强, 等.前列腺癌及良性前列腺增生组织中MnSOD基因的mRNA表达水平研究〔J〕.中国老年学杂志, 2006;26(2):1645.

　　6 Li N, Oberley TD, Oberley LW,et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase in DU145 human prostate carcinoma cells has multiple effects on cell phenotype〔J〕.Prostate, 1998;35(3):22133.