芪楮复筋方对大鼠坐骨神经损伤后再生和修复的作用

　　 作者：杨勤, 张亚声 作者单位：上海交通大学医学院附属第一人民医院中医科, 上海 200080

　　【摘要】 目的：探讨芪楮复筋方对大鼠坐骨神经损伤后的修复作用。方法：45只大鼠采用钳夹左侧坐骨神经法建立坐骨神经损伤模型，术后随机分为模型组、甲钴胺组和芪楮复筋方组。另15只正常大鼠作为正常对照组。甲钴胺组和芪楮复筋方组分别给予甲钴胺溶液[150 μg/(kg·d)]和芪楮复筋方煎液[35.2 g/(kg·d)]灌胃，模型组给予等量生理盐水灌胃。分别于术后第1、2和4周检测各组大鼠坐骨神经功能指数(sciatic function index，SFI)、腓肠肌湿质量残存率和腓肠肌肌细胞直径，免疫组织化学法检测神经组织S100表达，电子显微镜观察神经超微结构的改变。结果：术后第4周，甲钴胺组和芪楮复筋方组SFI、腓肠肌湿质量残存率、肌细胞直径、S100阳性表达率、有髓神经纤维髓鞘厚度及轴突直径与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，且均优于模型组(P<0.05，P<0.01)。除腓肠肌湿质量残存率和肌细胞直径外，甲钴胺组和芪楮复筋方组各指标间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：芪楮复筋方可促进周围神经损伤后神经的再生和功能恢复，延缓靶器官肌肉萎缩。

　　【关键词】 芪楮复筋方; 坐骨神经损伤; 神经再生; 肌萎缩; 大鼠

　　Effects of Qichu Fujin Recipe on regeneration and repairof injured sciatic nerve in rats

　　Qin YANG, Yasheng ZHANG

　　Department of Traditional Chinese Medicine, the First People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China

　　Objective: To explore the effects of Qichu Fujin Recipe (QCFJR), a compound traditional Chinese medicine, in repairing sciatic nerve injury in rats.Methods: A total of 60 male SpragueDawley (SD) rats were randomly divided into four groups: normal control group, untreated group, mecobalamin group and QCFJR group. Except the normal control group, sciatic nerve injury was induced by crushing of left sciatic nerve. Rats in the mecobalamin group were intragastrically administered with mecobalamin solutions 150 μg/(kg·d), and rats in the QCFJR group were intragastrically administered with QCFJR 35.2 g/(kg·d), while rats in the untreated group were intragastrically administered with normal saline (0.5 mL/d), once a day for 4 weeks respectively. Sciatic function index (SFI) was determined by walking tract analysis 1 week and 2 and 4 weeks after crushing. Five rats in each group were sacrificed for histological observation at the different time points. The remnant rate of gastrocnemius wet weight and the diameter of gastrocnemius cells were calculated. Expression of S100 protein in the distal stump of injured nerve was observed by using immunohistochemical method. Distal injured sciatic nerves were determined with toluidine blue staining and observed under a light microscope 1 week and 2 and 4 weeks after operation. Diameter of axon and depth of myelin sheath were calculated by an image analysis system. Ultrastructure of nerve fibers was determined with uranyl acetate and lead citrate staining and observed under an electron microscope.Results: Compared with the normal control group, SFI, remnant rate of gastrocnemius wet weight, diameter of gastrocnemius cells, expression of S100, diameter of axon and depth of myelin sheath in the mecobalamin group and the QCFJR group were significantly decreased at different time points (P<0.05), superior to those of the untreated group (P<0.05, P<0.01). Except the remnant rate of gastrocnemius wet weight and the diameter of gastrocnemius cells, there were no significant differences in other indexes between the mecobalamin group and the QCFJR group 1 week and 2 and 4 weeks after crushing (P>0.05).Conclusion: QCFJR can stimulate the regeneration and repair of nerve fiber and delay the skeletal muscle atrophy after sciatic nerve injury in rats.

　　Keywords: Qichu Fujin Recipe; sciatic nerve injury; nerve regeneration; muscle atrophy; rats

　　周围神经损伤后促进其再生和功能恢复是医学界的一大难题，目前该类疾病尚无特别有效的治疗方法。各种实验及临床研究显示，中药具有促进周围神经损伤后雪旺细胞增殖、神经生长因子蛋白表达，保护受损神经元和促进神经再生及结构重建的作用[13]。本实验采用大鼠坐骨神经损伤模型，探讨芪楮复筋方(Qichu Fujin Recipe, QCFJR)对外周神经损伤再生和功能恢复的促进作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，60只，雄性，体质量(200±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(沪)20070005。清洁级饲养，普通饮食，自由饮水。

　　1.2 实验药物 芪楮复筋方由黄芪50 g、楮实子30 g和血竭6 g组成，药材均购自上海雷允上药业有限公司。加3倍于药材体积的水浸泡过夜后煎煮，第1次煎煮1 h，第2次加3倍的水煎煮1 h，合并两次煎液，浓缩为每毫升中生药含量为10 g的煎液;甲钴胺片，卫材(苏州)制药有限公司，批号为080624A，0.5 mg/片，用生理盐水配制成15 μg/mL溶液。

　　1.3 大鼠坐骨神经损伤模型制备及分组 60只SD大鼠适应性饲养1周后，其中45只大鼠以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，参照Zhang等[4]手术方法制备坐骨神经损伤模型。在大鼠左侧股外侧做1.5 cm长切口，于臀肌间隙暴露坐骨神经，在坐骨结节下0.5 cm处用无齿钳子钳夹坐骨神经干3次，每次10 s，间歇10 s，钳夹强度统一咬合2齿，损伤宽度为3 mm，使神经干呈半透明状。损伤部位远端用90无创尼龙线标记，将神经放回原肌层，缝合皮肤。右侧坐骨神经仅暴露后缝合。造模过程中大鼠无死亡，术后测试造模大鼠展爪反射均消失。45只造模大鼠术后随机分为模型组、甲钴胺组和芪楮复筋方组。另15只正常大鼠不做任何处理作为正常对照组。术后第2天模型组大鼠予生理盐水0.5 mL/d灌胃，甲钴胺组大鼠予甲钴胺水溶液150 μg/(kg·d)灌胃，芪楮复筋方组予中药煎液35.2 g/(kg·d)灌胃，正常对照组不予灌胃处理。各处理组每天灌胃1次，连续给药28 d。各组大鼠分别于术后第1、2和4周处死并取材。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 一般状态 观察大鼠的一般情况，包括食欲、精神状态和足部溃疡情况，并记录大鼠是否死亡。

　　1.4.2 坐骨神经功能指数的测定 参照Lowdon等[5]改进的测量坐骨神经功能指数(sciatic function index，SFI)的方法。将大鼠放在蘸溴酚蓝溶液的纸上，取大鼠清晰足迹的图像，每足3～4个。测量以下指标：足印长度(print length，PL)，从足跟到足尖的最长距离;足趾宽度(toe spread，TS)，第1趾到第5趾的连线距离;中间足趾距离(intermediary toe spread，IT)，第2趾到第4趾的连线距离。参照Bain等[6]的方法，将上述3个变量代入公式计算SFI。SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。公式中E代表手术侧，N代表假手术侧。公式计算结果0为正常，-100为神经完全损伤，功能丧失。

　　1.4.3 腓肠肌湿质量测定 完整取下两侧小腿腓肠肌，分别从近端(股骨内外髁起点)和远端(跟腱止点处)剪断，立即用滤纸吸干水分，在万分之一分析天平上迅速称取质量。手术侧与自体健侧比较，求其湿质量的残存率。残存率(%)=(手术侧湿质量/自体健侧湿质量)×100%。

　　1.4.4 腓肠肌肌细胞直径测量 称取腓肠肌湿质量后，取手术侧腓肠肌中段(肌腹最大处)肌块，投入4%多聚甲醛溶液内固定过夜，经脱水、透明、浸蜡、包埋，做石蜡横切片，片厚5 μm，苏木精和伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色。各组随机选取5张切片，每张切片用Image Pro Plus图像分析系统(Nikon Eclipse E600，YFL，078077，Japan)随机测量50个肌细胞的最大横径，取其均值作为肌细胞的直径进行分析。

　　1.4.5 免疫组织化学法检测神经组织S100的表达 腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，暴露坐骨神经。根据标记取坐骨神经损伤处远端3 mm，以及正常大鼠坐骨神经标本。4%多聚甲醛溶液固定过夜，经常规脱水，石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。每个标本取5张切片，烘干，脱蜡。3% H2O2处理10 min阻断内源性过氧化物酶，经0.05%胰蛋白酶37 ℃处理30 min，充分暴露抗原后，加入10%羊血清37 ℃封闭30 min。吸除血清，加入兔抗S100单克隆抗体(1︰800，DAKO公司)，4 ℃冰箱孵育过夜。生物素化羊抗兔IgG(1︰200, DAKO公司)37 ℃孵育30 min。新鲜配制2%二氨基联苯胺显色液室温下显色，0.01 mol/L PBS充分漂洗终止反应，苏木素复染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。空白对照用0.01 mol/L PBS代替一抗，其余各步骤与上述操作相同。每组免疫组织化学标本采用光学显微镜摄取图像，每根神经取5个不同视野，采用Image Pro Plus图像分析系统进行分析。

　　1.4.6 光学和电子显微镜观察与图像分析 按上述方法取材，常规固定、脱水、包埋后，半薄切片(1 μm)，经甲苯胺蓝染色，于光学显微镜下观察，图像分析系统测量有髓神经纤维轴突直径、髓鞘厚度;Leica切片机70 nm超薄切片，经醋酸铀、枸橼酸铅染色后在透射电子显微镜(Philips Tecnai 12 Biotwin)下观察神经纤维超微结构并拍照。

　　1.5 统计学方法 各组计量资料以x±s表示，采用析因设计方差分析进行组间比较，组间两两比较用LSDt检验。数据均采用SPSS 16.0软件分析，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 一般状态 各组均无大鼠死亡。术后大鼠睡眠及食欲无明显变化。术后第1周，各组大鼠术侧足趾屈曲，后肢运动障碍，拖地行走。部分大鼠术侧足部出现不同程度的溃疡，芪楮复筋方组大鼠足部溃疡程度较其他处理组轻，至第2周后溃疡基本消退。第3周开始，大鼠后肢逐渐可着地，行走时脚趾可分开，治疗组情况较模型组好。取材时芪楮复筋方组坐骨神经损伤处表面比模型组光滑，外膜血管丰富，容易从组织中分离。

　　2.2 SFI的测定 各处理组大鼠术后即出现显著的坐骨神经功能受损表现，术后第3天SFI均在-80～-100。而术后第1、2和4周坐骨神经功能逐渐恢复(见表1)。步态实验结果显示，第1周末各处理组大鼠手术侧脚印较模糊，脚趾无法分开，PL明显增长，TS变窄，至第4周末芪楮复筋方组大鼠术侧脚印清晰，五趾明显分开(见图1)。SFI测定显示治疗组效果优于模型组，这种优势在第4周尤为明显，甲钴胺组和芪楮复筋方组的SFI分别与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。但甲钴胺组和芪楮复筋方组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 腓肠肌湿质量测定 各处理组大鼠手术侧腓肠肌肉眼观察显示，芪楮复筋方组最饱满，较有光泽与弹性，甲钴胺组次之，模型组最差。腓肠肌湿质量的残存率随实验时间的延长均逐渐下降，其中模型组下降速度最快，芪楮复筋方组最慢。第1和第2周各手术组之间的残存率差异无统计学意义，但第4周时，治疗组的残存率高于模型组(P<0.05)，芪楮复筋方组又高于甲钴胺组(P<0.05)。见表2。表1 各组坐骨神经功能指数

　　2.4 腓肠肌细胞直径测量 术后第1周模型组肌纤维直径与正常对照组相比显著减小，形态不规则，大小不一，肌纤维结构紊乱，皱缩明显，细胞间隙明显增宽，结缔组织明显增生，肌纤维呈现明显萎缩变性状态;第4周各治疗组肌纤维形态较规则，染色较均一，大部分肌细胞核仍紧贴于肌纤维的周边，肌纤维肿胀与空泡样变性不明显，少见结缔组织增生，细胞间隙略增宽，肌纤维呈现轻度萎缩变性状态。各时间点模型组肌细胞直径与其余各组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。至第4周，芪楮复筋方组肌细胞直径与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与模型组和甲钴胺组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

　　2.5 坐骨神经S100蛋白的表达 正常神经S100染色后可见神经细胞排列紧密，结构清晰，髓鞘内外轴膜染成棕色。术后第1周，模型组大部分髓鞘明显发生肿胀，呈空泡样变，轴突溃变崩解成碎片，表现为浓染的碎片或中空的戒指环状结构，雪旺细胞数量在此时达到高峰。各处理组S100染色呈强阳性，芪楮复筋方组染色深度明显较其余组强。术后第2周，非成髓鞘雪旺细胞数量开始下降，S100阳性染色较第1周减弱，芪楮复筋方组神经纤维与其余处理组相比，排列规则、较紧密，染色略深。术后第4周，各处理组可见直径较小的新生髓鞘，髓鞘组织呈现S100染色阳性，但模型组髓鞘排列较为稀疏，雪旺细胞形成髓鞘的数量较少，仍可见空泡变性。芪楮复筋方组髓鞘数量明显较模型组增多，而且排列较致密，规整。见图2。

　　2.6 坐骨神经病理改变 光学显微镜下显示，正常对照组神经纤维排列紧密，髓鞘完整、厚度均匀;术后第4周模型组损伤远端坐骨神经轴突大小不一、形状各异、排列松散;芪楮复筋方组新生纤维较多，有髓神经纤维比例增多，排列紧密。经图像分析软件系统测量，各处理组与正常对照组相比，轴突直径和髓鞘厚度差异有统计学意义(P<0.01)，芪楮复筋方组髓鞘厚度与其余两组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，但各处理组的轴突直径差异无统计学意义(P>0.05)。见图3和表4。表2 各组腓肠肌湿质量的残存率表4 各组术后第4周轴突直径和髓鞘厚度

　　2.7 神经超微结构观察 虽然各处理组大鼠损伤的神经都有一定程度的再生，但再生的速度和质量有所不同。术后4周，模型组仍可见变性的纤维，再生神经纤维排列稀疏，髓鞘薄，轴突细小且形态各异，细胞器少见，成熟度差;甲钴胺组和芪楮复筋方组可见大量新生神经纤维增生，排列较整齐、致密，髓鞘增厚，趋于完整，雪旺细胞多见且形态均一，细胞器明显，治疗组改善效果明显优于模型组。见图4。

　　3 讨 论

　　周围神经损伤后，神经损伤远端发生沃勒变性(Wallerian degeneration)，雪旺细胞增殖形成Bungner带，与巨噬细胞一同吞噬变性的轴突髓鞘，同时雪旺细胞可分泌多种生物活性物质如神经营养因子和黏附分子等，维持神经元的活性，引导轴突的有序延伸，促进轴突的髓鞘化。因此雪旺细胞的增殖对神经再生起很重要的作用。S100蛋白作为一种钙结合蛋白[7]，有α和β两种亚型。S100β主要存在于中枢神经的胶质细胞，S100α则存在于外周神经雪旺细胞的细胞质和髓鞘中。作为周围神经的标志蛋白质，S100α既可以反映周围神经损伤后雪旺细胞的增殖情况，又可以反映髓鞘的形成情况[8]。本实验研究发现，芪楮复筋方组损伤神经远端S100α的表达量在第1、2和4周均较相同时间点其他组增加，通过光学显微镜及电子显微镜观察，至第4周末，该组再生髓鞘的数量、厚度、轴突直径及神经纤维的成熟度均优于模型组，证明芪楮复筋方能促进雪旺细胞的增殖和轴突的再生，加快神经功能的恢复。

　　靶器官肌肉发生不可逆萎缩也是周围神经损伤后治疗的难点。神经损伤后，神经冲动无法到达靶器官，使神经肌肉丧失主动收缩能力，造成骨骼肌瘀血，继而成纤维细胞和胶原纤维增生，骨骼肌发生坏死和肌纤维化，运动终板严重退变，即使神经再生到达骨骼肌效应器也不可能恢复其功能。周围神经损伤后，肌肉湿质量和肌细胞直径随失神经支配时间的延长呈进行性下降，是肌肉萎缩的可靠形态学指标[9]。因此本实验通过腓肠肌肌细胞直径变化的观察来评估失神经后腓肠肌的状态和神经再生的情况。甲钴胺作为一种目前国内常用的治疗周围神经损伤的药物，在促进髓鞘再生方面的作用已得到公认，但其能否防止肌肉萎缩，尚存在争议。本实验结果显示，在第4周，芪楮复筋方组能显著提高腓肠肌湿质量的残存率，肌细胞直径也接近正常对照组，明显优于模型组和甲钴胺组，说明其在延缓骨骼肌萎缩，保护靶器官方面较甲钴胺有一定的优势。

　　无论是促进雪旺细胞的增殖还是延缓靶器官的萎缩，再生修复的根本目的是提高周围神经功能恢复率，而最理想的功能恢复指标是行为指标。1982年，de Medinaceli等[10]首次提出用大鼠SFI评价坐骨神经损伤后功能恢复的情况，被称为足迹分析法(walking tracks analysis)，并推导出SFI计算公式，后经Carlton和Bain等的反复实验与修改，SFI计算公式更加完善，被广泛应用于实验研究中。SFI不仅是评价坐骨神经损伤后功能恢复的可靠标准，而且又能反映下肢肌张力恢复的情况和下肢各肌肉的协调功能。实验结果表明，坐骨神经损伤1周后各组SFI均有不同程度的恢复。随着时间的延长，步态实验显示，芪楮复筋方组大鼠的脚印日渐清晰，SFI高于模型组，差异有统计学意义，证明该方能促进坐骨神经损伤后神经功能的恢复。

　　周围神经损伤属于中医“伤筋”、“痿证”的范畴。周围神经由于外伤、受压等因素而致气血运行受阻，瘀血阻滞;病发日久，正气耗伤可致气血双亏，筋脉肌肉失养;伤筋必动骨，伤骨必损筋，肾主骨，肝主筋，肝肾不足必然导致筋骨活动不利，关节功能不易恢复。正如《杂病源流犀烛·跌扑闪挫源流》中说：“跌扑闪挫，卒然身受，由外及内，气血俱伤病也。”因此中医认为在神经损伤早期主要是气滞血瘀，中晚期为气血两虚、肝肾受损。芪楮复筋方中含有黄芪、楮实子、血竭3味中药。方中黄芪甘温，具有补气升阳、利水消肿、生肌的作用，为君药;楮实子性寒味甘，入肝、肾经，能调补肝肾，用以为臣;佐以血竭活血化瘀、生肌、舒筋活络。全方共奏益气补肾、活血通络之功。

　　芪楮复筋方能促进周围神经损伤后的修复，尤其在延缓靶器官肌肉萎缩方面有一定的疗效。周围神经损伤的治疗是一个极其复杂的过程，如何采用多方面的措施干预，使其作用优势叠加、整合以发挥最大的治疗作用是今后努力的方向。

　　【参考文献】

　　1 Yang DM, Du C, Dang Y, Fu ZG, Jiang BG. Longterm effects of modified formula Radix Hedysari on enhancement of nerve regeneration: an experiment study in a sciatic nerve injury model. Zhonghua Shou Wai Ke Za Zhi. 2007; 23(5): 302304. Chinese with abstract in English.

　　杨德梅, 杜婵, 党育, 付中国, 姜保国. 复方红芪减方提取液促进坐骨神经损伤后修复的实验研究. 中华手外科杂志. 2007; 23(5): 302304.

　　2 Zhang DG, Zhao Y, Xia PJ, Huang XQ, Liu ZM, Zhou H. Effects of Tongluo Recipe on experimental diabetic peripheral neuropathy in rats. J Chin Integr Med. 2006; 4(6): 601605. Chinese with abstract in English.

　　张德刚, 赵瑛, 夏培金, 黄宵群, 刘志民, 周晖. 通络方剂改善糖尿病大鼠周围神经病变作用机制的探讨. 中西医结合学报. 2006; 4(6): 601605.

　　3 Yin ZS, Gu YD, Gu YH, Zhu TF. The effect of Chinese herbs on nerve growth factor (NGF) protein expression after sciatic nerve injury at rats. Zhonghua Shou Wai Ke Za Zhi. 2003; 19(1): 5557. Chinese with abstract in English.

　　尹宗生, 顾玉东, 顾映红, 朱腾方. 中药治疗对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子蛋白表达的影响. 中华手外科杂志. 2003; 19(1): 5557.

　　4 Zhang Y, Anderson PN, Campbell G, Mohajeri H, Schachner M, Lieberman AR. TenascinC expression by neurons and glial cells in the rat spinal cord: changes during postnatal development and after dorsal root or sciatic nerve injury. J Neurocytol. 1995; 24(8): 585601.

　　5 Lowdon IM, Seaber AV, Urbaniak JR. An improved method of recording rat tracks for measurement of the sciatic functional index of de Medinaceli. J Neurosci Methods. 1988; 24(3): 279281.

　　6 Bain JR, Mackinnon SE, Hunter DA. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast Reconstr Surg. 1989; 83(1): 129138.

　　7 Schlaepfer WW, Micko S. Chemical and structural changes of neurofilaments in transected rat sciatic nerve. J Cell Biol. 1978; 78(2): 369378.

　　8 FernandezValle C, Bunge RP, Bunge MB. Schwann cells degrade myelin and proliferate in the absence of macrophages: evidence from in vitro studies of Wallerian degeneration. J Neurocytol. 1995; 24(9): 667679.

　　9 Xu JG, Gu YD. Experimental study of morphology and electrophysiology on denervated skeletal muscle. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 1999; 13(4): 202205. Chinese with abstract in English.

　　徐建广, 顾玉东. 失神经支配骨骼肌退变组织形态学及电生理实验研究. 中国修复重建外科杂志. 1999; 13(4): 202205.

　　10 de Medinaceli L, Freed WJ, Wyatt RJ. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Exp Neurol. 1982; 77(3): 634643.