脂质体介导的cFLIP反义寡核苷酸对肾细胞癌的凋亡作用

　　作者：毛昕,潘铁军,叶章群　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北武汉 430030

　　【摘要】目的探讨cFLIP反义寡核苷酸(ASODN)对肾细胞癌的抑制作用。方法 设计合成cFLIP的ASODN，按不同浓度在脂质体介导下转染7860肾癌细胞株，设无义(NSODN)和空白对照组进行比较。观察细胞的生长状态，Western blot检测cFLIP蛋白的表达，MTT法检测细胞生长抑制率，应用流式细胞仪检测其凋亡率。结果 与NSODN、空白对照组比较，ASODN组cFLIP蛋白表达显著降低(P<0.05)，细胞抑制率(分别为10μmol/L组34.20%,20μmol/L组39.50%)显著增高，上述效应呈浓度依赖性;镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退，当转染浓度至20μmol/L时，其凋亡率(56.11%)显著高于空白对照组(7.29%)和NSODN(4.69%)组。结论 ASODN能特异性封闭肾癌细胞cFLIP基因的表达，并可抑制肾癌细胞的增殖，诱导其凋亡。

　　【关键词】 肾癌;TRAIL;cFLIP;反义寡核苷酸(ASODN);凋亡

　　细胞凋亡失控是恶性肿瘤的重要标志，在癌细胞异质化过程中发生的多种基因表达改变使其抵抗死亡受体诱导的凋亡，逃避人体免疫监视机制，从而造成浸润和转移。cFLIP基因是近年发现的凋亡抑制基因，在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在，能够明显抑制死亡受体介导的凋亡[12]。cFLIP基因在哺乳动物细胞内编码多种拼接体，表达两种蛋白产物，即cFLIPL和cFLIPS，多数资料表明，抑制凋亡作用主要来自cFLIPL[35]。cFLIP抑制肿瘤细胞凋亡的作用在很多研究中已得到证实[68]。cFLIP基因的反义寡核苷酸能否封闭cFLIP蛋白的表达，从而使肾癌细胞执行死亡受体介导的凋亡，这一点国内外未见报道。本研究旨在探讨cFLIP反义寡核苷酸对肾癌细胞系7860的影响，为肾癌反义基因治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养 人肾透明细胞癌株7860购自中国科学院上海细胞研究所。用RPMI1640培养液，在37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，消化传代，2-3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2 脂质体寡核苷酸转染复合物的制备 以cFLIP基因翻译起始区为靶点，人工合成cFLIP反义寡核苷酸(ASODN)及对照无义寡核苷酸(NSODN)，经全硫代修饰、纯化、冻干粉保存备用(捷倍思，上海)。反义序列：5′GACTTCAGCAGACATCCTAC3′(20个碱基)，无义对照序列：5′TGGATCCGACATGTCAGA3′(18个碱基)。脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)介导寡核苷酸转染方法按照厂商说明书进行，ODN、Lipofectamine比例为1μg∶3μL。

　　1.3 细胞分组和转染 分别按5、10、20μmol/L ASODN和20μmol/L NSODN转染浓度进行分组。将对数生长期细胞经消化后，以RPMI 1640培养基配成1×106/mL细胞悬液,接种于2块24孔板中(1mL/孔)，常规培养24h。观察细胞达80%融合后，吸弃培养液，依组别加入1mL各浓度转染复合物，48h后倒置显微镜观察细胞形态，收集细胞备测。空白对照组以无血清RPMI 1640代替寡核苷酸复合物，平行操作。

　　1.4 Western blot检测cFLIP蛋白的表达 收集各组细胞，采用紫外分光光度法行蛋白定量。以30μg/孔上样，凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，封闭后加入山羊抗人cFLIP蛋白单克隆抗体(美国Santa Cruz)，使用Western blot试剂盒(博士德，武汉)进行杂交反应，染色并进行分析摄像，计算条带积分吸光度(IA)，IA=平均吸光度×面积。

　　1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率 收集培养细胞，按前述程序进行分组(每组设3个复孔)和转染后，每孔加RPMI 1640培养液和MTT，孵育4h后吸弃培养基，加二甲基亚砜100μL/孔，振摇溶解结晶。酶联免疫检测仪490nm波长测吸光度值(A)，计算细胞增殖抑制率。抑制率(IR)=(空白对照组A值)-(实验组A值)/(对照组A值)×100%。

　　1.6 Hoechst荧光染色观察凋亡和流式细胞仪检测细胞凋亡率 Hoechst荧光染色观察凋亡：按试剂盒操作说明书进行。细胞固定、封片，荧光显微镜下观察，摄像。

　　采用人Annexin VFITC试剂盒(晶美公司)测转染后肾癌7860细胞凋亡。具体方法：收集各组细胞，离心弃上清。加入Buffer和FITC标记的AnnexinV，PI染色，用FACScan进行流式细胞术定量检测。

　　1.7 统计学处理 实验结果用SPSS 11.5统计软件对相关数据行χ2检验和t检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学变化 荧光显微镜下，对照组和SODN组细胞形态基本正常，ASODN组随转染浓度增加7860细胞有典型的细胞凋亡改变，表现为细胞核出现波纹，核染色质聚集、边缘化，有的细胞核裂解为大小不等的碎块，细胞周边出现凋亡小体。

　　7860癌株加入20μmol/L ASODN后呈现的凋亡形态 (Hoechst荧光染色 ×400)

　　2.2 各组细胞cFLIP蛋白表达 Western blot分析表明，对照组和NSODN组细胞有较高水平的cFLIP蛋白表达，转染ASODN后cFLIP蛋白表达开始下降，随转染浓度增加呈梯度性抑制,10、20μmol/L ASODN组表达强度显著低于对照组和NSODN组(P<0.05)。

　　2.3 ASODN对细胞生长的抑制作用 细胞转染48h后，ASODN 10μmol/L组和20μmol/L组IR(34.20%，39.5%)显著高于NSODN组(5.26%)(P<0.05)，表明ASODN对细胞生长有抑制作用。

　　2.4 ASODN对细胞凋亡的影响 ASODN组细胞在转染48h后出现凋亡，随转染浓度增加渐趋明显。20μmol/L ASODN组凋亡率(56.11%)显著高于对照组(7.29%)和NSODN组(4.69%)(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　肿瘤常因破坏了细胞的动态平衡，肿瘤细胞在体内无控制增殖，最终导致器官组织的功能丧失和死亡。近几年，已经证明TRAIL及Fas受体是肿瘤免疫监视的关键调节者[910],体内外的实验均证实他们能够诱导肿瘤细胞的凋亡。然而，不是所有的肿瘤细胞都对他们诱导的凋亡敏感。1997年，Irmler等[1]在研究恶性黑色素瘤时发现，肿瘤细胞内有一种结构类似caspase 8，但不具备酶活性的蛋白高表达。它具有2个死亡效应区(DED)，因而可竞争性地与FADD或caspase 8上的DED结合，阻断死亡信号复合体(DISC)形成，从而抑制凋亡。该蛋白即是cFLIP。cFLIP基

　　 Annexin V检测空白对照组、无义组和20μmol/L反义组的凋亡率

　　LR+UR代表各组的凋亡率因定位于人染色体2q33。其蛋白形式有2种：长链cFLIPL和短链cFLIPS。抑制凋亡作用主要来自cFLIPL，它在肿瘤中常常过表达，在TNF超家族的死亡受体抑制剂中扮演了一个重要角色，成为死亡受体诱导凋亡的主要调节物，能够抑制肿瘤细胞的凋亡，因此特定改变cFLIP表达水平的基因药物无疑将给肿瘤治疗带来新的前景。

　　本研究结果表明，ASODN能够特异性封闭cFLIP蛋白的表达，并且与ASODN的浓度密切相关，随着ASODN浓度的增加，cFLIP蛋白的表达越低。MTT实验证明细胞生长显著受抑，细胞增殖抑制率与反义寡核苷酸浓度呈正相关;流式细胞实验证明细胞凋亡，并且随着ASODN浓度的增加，凋亡率也随之增加，这些结果印证了我们预先的设想。本实验结果证明，靶向cFLIP的反义寡核苷酸可以有效抑制肾癌细胞系7860细胞的生长，诱导其凋亡。

　　总之，通过cFLIP ASODN对7860细胞转染实验证实，体外应用ASODN能够有效封闭cFLIP表达，抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡，从而为进一步体内实验提供了依据。因此利用反义核酸技术的高度特异性开展针对cFLIP的靶向治疗，将可能为肾癌的基因治疗开辟新的途径。

　　【参考文献】

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