染色体着丝粒探针在膀胱肿瘤诊断中的应用
发表时间：2011-10-13 浏览次数：469次
作者：熊廷川,汪清,张宇,胡岚亭,曾庆山 作者单位：1新疆医科大学; 2新疆维吾尔自治区人民医院泌尿外二科, 新疆乌鲁木齐830000
【关键词】 染色体着丝粒探针 膀胱肿瘤
(Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)Abstract: Objective: To investigate the feasibility and effectiveness of the fluorescence in situ hybridization techniqne in the diagnosis of bladder cancer. Methods: The method of random primer was used to label the No. 3, 7 chromosome probe. FISH was performed on the urine exfoliated cells nuclear from 66 suspected cases of bladder cancer. The patients have had tests including the cystoscope biopsy, postoperative pathology to diagnose the cancer and its grade and stage. The urine exfoliated cell examination was also conducted. Results: The FISH technique diagnosed bladder cancer with a sensitivity of 72.4% and specificity of 62.5%. Among the 58 bladder cancer cases, the variation rate of chromosome 3, 7 was 67.24(39/58), 68.96%(40/58) respectively. The rate was correlated with the pathological grade of cancer (P<0.05), but not with the pathological stage (P>0.05). The specificity and sensitivity of the cytology were 100% and 13.79% (8/58)respectively. Conclusion: It is noninvasive and effective to diagnose bladder cancer with the techique of FISH. This method is more sensitive than the urine exfoliated cell examination, while on specificity, there are no obvious differences.
Key words: bladder cancer; fluorescence in situ hybridization; abnormality of chromosome; diagnosis膀胱癌是世界十大恶性肿瘤之一,在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中,膀胱癌的发病率和死亡率均占首位,且二者呈逐年上升趋势[1]。尿路上皮癌是其中最为常见的病理类型，约占膀胱肿瘤的90%。随着分子生物学技术的发展，近年来出现了一些经尿液检测膀胱肿瘤的新方法,如尿核基质蛋白(NMP22)、膀胱肿瘤抗原(BTA)、BTA Stat、ImmunoCyt、端粒酶分析、血红蛋白检测片、Survivin等也可用于诊断膀胱癌,但它们敏感性和特异性仍不满意[2-3]。最近报道尿脱落细胞荧光原位杂交技术能发现膀胱癌染色体改变,可用于诊断膀胱癌，而且灵敏度、特异性比较高[4]。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种应用荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体中显示DNA序列位置的方法。FISH技术是分子细胞遗传学最常见的研究手段之一，其主要用于染色体变异数目与结构畸变的研究。本实验运用随机引物法标记第3号、7号染色体着丝粒探针诊断膀胱肿瘤，旨在探讨荧光原位杂交技术(FISH)在诊断膀胱肿瘤中的可行性及有效性。
1资料与方法
1.1试验对象收集2008年3月～11月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院泌尿科住院患者，共66例疑似膀胱肿瘤患者晨尿标本，其中男性41例，平均年龄(64.4±13.7)岁，女性25例，平均年龄(62.1±9.5)岁。
1.2纳入与排除标准纳入标准：(1)年龄>40岁;(2)全程无痛性肉眼或镜下(每高倍视野红细胞>3个)血尿;(3)B超、CT、MR、静脉肾盂造影、膀胱造影等相关检查提示高度怀疑膀胱肿瘤的患者。排除标准：(1)感染、结石、血液疾病所致血尿;(2)肾炎、药物刺激、出血性疾病引起的血尿。
1.3标本收集与处理收集疑似膀胱肿瘤患者晨起中段尿液200 ml，经离心、去杂质、胃蛋白酶消化、变性、杂交、洗涤、复染等试验步骤。
1.4FISH判断(1)建立阈值：采集正常健康者的尿液，同样进行玻片制备及进行FISH实验。我们共处理38位健康者的尿液，20例能够计数，统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比。阈值=平均值(M)+3×标准差(SD);(2)每位患者每种探针分析100个细胞，如果检测值大于阈值，判断为阳性结果;如果检测值小于阈值，判断为阴性结果;如果等于阈值，加大观测样本细胞数目。
1.5病理诊断所有疑似膀胱肿瘤患者经膀胱镜活检或手术切除后病检，确诊是否是膀胱肿瘤，以及分期、分级。病理分级采用WHO的国际肿瘤组织学分类(WHO 2004)分级标准，病理分期采用国际抗癌联盟的2002年第6版TNM分期法。所有疑似膀胱肿瘤患者同时进行尿脱落细胞学检查。
1.6统计学处理进行FISH检查人员实行双盲法。统计分析使用SPSS13.0软件包，计数资料用χ2检验，计算灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比、符合率及Kappa值，P值为双向，检验水准α =0.05。
2结果
2.1建立阈值38位健康者的尿液中20例能够计数，根据公式统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比。阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)。
表1阈值(%)探针平均值(M)+3×标准差(SD)0个信号点1个信号点≧3个信号点CSP3-5.39.8CSP7-4.811.1
2.2FISH结果66例疑似膀胱肿瘤中，经膀胱镜活检或手术切除后病检，确诊为膀胱肿瘤58例。膀胱乳头状瘤1例，乳头状尿路上皮癌(低级别)30例，乳头状尿路上皮癌(高级别)23例，低分化腺癌2例，鳞癌2例。临床分期：Ta、Tis、T1期共32例，T2期20例，T3期4例 ，T4N2M1 2例。8例病理诊断非膀胱肿瘤，其中腺性膀胱炎5例，后尿道息肉1例，膀胱移行上皮细胞增生1例，子宫内膜异位症1例。FISH技术诊断膀胱肿瘤的灵敏度为72.4%，特异性为62.5%，Youden指数34.9%，阳性预测值PV+为93.3%,阴性预测值PV-为23.80%，阳性似然比1.93，阴性似然比0.44，Kappa值为0.205,见表2。表266例疑似膀胱肿瘤患者的FISH结果FISH结果病理诊断膀胱肿瘤非膀胱肿瘤合
2.3尿脱落细胞学检查结果66例疑似膀胱肿瘤患者中，尿脱落细胞学检查仅8例阳性，经病理证实均为乳头状尿路上皮癌(高级别)，灵敏度约为13.97%(8/58)，特异性100%。
尿脱落细胞学检查结果尿脱落细胞学病理诊断膀胱肿瘤非膀胱肿瘤合 计阳性808阴性50858合计58866
2.4膀胱肿瘤中染色体畸变情况正常对照组的尿脱落细胞第3、7号染色体均表现为二个杂交信号:两红两绿，腺癌、鳞癌的FISH结果均为阴性。在58例确诊为膀胱肿瘤的患者中，第3、7号染色体变异率分别为67.24%(39/58)、68.96%(40/58)，畸变与肿瘤分期无明显相关性(r=0.106, P>0.05; r=0.154, P<0.05)。畸变程度与膀胱肿瘤病理分级呈正相关性(r=0.392, P<0.05; r=0.543, P<0.05)，在尿路上皮癌(低级别)患者中FISH试验结果显示第3、7号染色体红绿信号以多倍体为主，在尿路上皮癌(高级别)患者中FISH试验结果显示第3、7号染色体红绿信号以多倍体为主，可见红绿信号多倍体同时出现在一个细胞内，畸变程度较高。
图1正常对照组FISH结果图2尿路上皮癌(低级别)FISH结果图3尿路上皮癌(高级别)FISH结果3讨 论尿脱落细胞学检查因其简便、无创及可评价全尿路病变的特点,在膀胱癌诊断、疗效观察和术后监测中有着重要地位。传统的尿脱落细胞学检查可以确诊70%～90%的高度恶性移形细胞癌及移形细胞原位癌，然而尿脱落细胞学对低级别肿瘤的诊断敏感性则较低[5]。本实验尿脱落细胞学检查阳性的仅8例，灵敏度为13.97%(8/58)，且均经病检证实为膀胱尿路上皮癌(高级别)，在全部确诊为膀胱尿路上皮癌(高级别)30例中占30.0%(9/30)，明显低于上述文献报道。说明尿脱落细胞学检查在高恶性膀胱肿瘤诊断中灵敏度偏低，而且在低级别膀胱肿瘤诊断中的灵敏度较低，与人们期望的理想值有一定的差距。由于尿脱落细胞学诊断膀胱肿瘤的灵敏度不理想，FISH技术正逐步被用来辅助性诊断膀胱肿瘤，且大量文献报道也证实了FISH技术在膀胱肿瘤的诊断中灵敏性和特异性都较高。Halling等[6]曾报道FISH诊断的灵敏度、特异性都为81%，Constantinou等[7]研究证实FISH的诊断灵敏度在膀胱肿瘤pT1、pT2、pT3分别为80%、100%、100%，Houskova等[8]的研究则认为FISH的诊断灵敏度在膀胱肿瘤G1、G2、G3的灵敏度分别为63.6%、64.3%、91.7%。Riesz等[9]曾报道FISH的灵敏度和特异性分别87%、100%，且指出肿瘤浸润程度与细胞染色体的变异度呈正相关，本实验中FISH诊断灵敏度为72.4%，与上述文献报道的结果相比略低，可能与本实验样本量较少有关，需进一步加大样本量。Bergman等[10]近来也报道了FISH技术与尿脱落细胞学检查，分别在膀胱肿瘤诊断的灵敏度、特异性差异，FISH技术在灵敏度方面明显优于尿脱落细胞学检查,特异性未见明显差异。Onishi等[11]研究认为FISH技术在中、低级别膀胱肿瘤的诊断中相比尿脱落细胞学检查具有较高的灵敏性(FISH:66.7%;细胞学检查:11.1%)。MarínAguilera等[12]也发现FISH在中、低级别的膀胱肿瘤诊断中的灵敏度显著优于尿脱落细胞学检查(FISH:52.8%;细胞学检查:13.9%)。在本实验中，FISH诊断与传统尿脱落细胞学检查的灵敏度分别为72.4%和13.97%(P<0.05)，特异性分别为62.5%和100%(P>0.05)，与上述文献报道结果相吻合。尿脱落细胞学与FISH两种诊断试验的灵敏度差异有统计学意义(χ2=46，P<0.05)。Halling等 [13]认为膀胱癌易发生非随机的染色体改变,包括结构畸变和染色体数目的异常。3号染色体异常在膀胱移行癌约占47.4%，且常与其他染色体的异常并存,与肿瘤分级相关，可预测肿瘤的浸润性。7号染色体畸形也常见于膀胱癌,以三倍体多见,约为50.9%，它可以单独出现在膀胱癌,但更多是伴有其他染色体改变[14]，在复发性和浸润性膀胱癌中该染色体的三倍体发生率较高，它的倍数与肿瘤分期和分级密切相关[15]。本实验中共有13例膀胱肿瘤术后复发，复发时间从术后1月至术后13年不等，3、7号染色体以多倍体为主，畸变率分别为46.15%(6/13)、38.46%(5/13)。在58例确诊为膀胱肿瘤的患者中，第3、7号染色体变异率分别为67.24%(39/58)、68.96%(40/58)，畸变程度与膀胱肿瘤病理分级呈正相关性(r=0.392,P<0.05; r=0.543, P<0.05)，畸变与肿瘤分期无明显相关(r=0.106,P>0.05;r=0.154,P<0.05)。第3号染色体畸变程度与膀胱肿瘤的病理分级的相关系数r <0.5,提示两者之间的相关关系并不密切，可能与我们的样本量不够大有关。综上所述，尿脱落细胞荧光原位杂交技术诊断膀胱癌,具有敏感度高、特异性强、无创性等优点，较传统尿脱落细胞学检查灵敏度高，但特异性无明显差异，这有待进一步研究，尚需要增大样本量，研究染色体在尿路上皮癌、非尿路上皮癌患者中尿脱落细胞的畸变情况。
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