Smac 和Livin在肾细胞癌组织中表达及意义

　　作者：王浦,刘勇,王世平,马炎　　作者单位：青岛大学医学院附属医院泌尿外科，山东 青岛

　　【摘要】 目的 探讨Smac和Livin在肾细胞癌(肾癌) 组织中的表达及两者在肾癌细胞凋亡中的作用和关系。方法 应用半定量RT-PCR技术检测49例肾癌组织和20例正常肾组织Smac和Livin mRNA表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Smac和Livin蛋白表达情况。结果 Smac mRNA及其蛋白在肾癌组织中的表达显著低于正常肾组织(χ2=5.929、6.538，P<0.05)，Livin mRNA及其蛋白在肾癌组织中的表达显著高于正常肾组织(χ2=27.600、23.351，P<0.05)，且两者均与肾癌临床病理参数有关。在肾癌组织中，Smac和Livin表达强度之间呈负相关(r=-0.39,P<0.05)。结论 Smac在肾癌组织中低表达，其表达与Livin呈明显的负相关，两者可能是肾癌细胞凋亡信号传导网络中的重要一环。

　　【关键词】 癌,肾细胞;Smac;Livin;细胞凋亡

　　EXPRESSIONS OF Smac AND Livin IN RENAL CELL CARCINOMA TISSUE　　WANG PU, LIU YONG, WANG SHI-PING, et al　　Department of Urology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　[ABSTRACT]Objective[ To investigate the expressions of Smac and Livin and their association with apoptosis in renal cell carcinoma (RCC). Methods The expressions of Livin and Smac mRNA were detected using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and ELISA for tissues of 49 RCC and 20 normal kidneys. Results Expressions of Smac mRNA and protein in RCC tissue were significantly lower than that in normal renal tissue (χ2=5.929，6.538;P<0.05), while expressions of Livin mRNA and protein in RCC tissue were higher than the normal one (χ2=27.600,23.351;P<0.05). Both Smac and Livin expressions were related with parameters of clinical pathology. A negative correlation was observed between the expressions of Smac and Livin in RCC (r=-0.39,P<0.05). Conclusion Smac expression was lower in RCC, which shows a negative correlation with Livin. These two genes are probably an important link in the apoptosis signal transduction network of RCC cells.

　　[KEY WORDS] Carcinoma, renal cell; Smac; Livin; Apoptosis

　　细胞凋亡是机体维持内环境稳定的重要机制之一，如果细胞凋亡受抑，细胞死亡率下降，将导致细胞数目不断增加，表现出生长优势，这是肿瘤形成的一个重要基础。细胞凋亡是基因表达的结果，受促凋亡基因和抑凋亡基因的调控[1]。许多与凋亡和增殖有关的基因如p53、Fas/FasL、Smac、Bcl-2、IAP等都与肾细胞癌(简称肾癌)的发生发展有关，Smac和Cyt-C是一起由线粒体释放到细胞质的重要的凋亡调节子,Smac存在于哺乳动物细胞中，能直接与凋亡抑制蛋白(IAP)结合，使其丧失抑制Caspase 活性的作用，因此Smac 在细胞凋亡的途径中有着极其重要的作用[2]。Livin 属于IAP 家族新成员,是具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白。本研究旨在探讨Smac和Livin在肾癌组织和正常肾组织中的表达及两者的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本

　　2007年10月～2008年3月，收集青岛大学医学院附属医院泌尿外科手术切除的肾癌标本49例, 男30例, 女19例，年龄29～82岁，平均42.7岁。均经病理学检查证实为肾透明细胞癌，其中高分化12例，中分化26例，低(未)分化11例;Ⅰ期21例，Ⅱ期13例, Ⅲ期10例，Ⅳ期5例。正常肾组织20例，取自肾结石或重度肾积水病人并经病理学证实，其中男12例，女8例，年龄34～67岁，平均52.0岁。所有病人术前均未行放疗、化疗或介入栓塞治疗。术后立即切取标本，用无菌生理盐水冲净血液后迅速置于液氮中，后转移至-70 ℃冰箱保存备用。

　　1.1.2 主要试剂

　　RNA提取液Trizol、PrimeScript RT-PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司，ELISA试剂盒购自美国Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RT-PCR检测Smac和Livin基因mRNA表达

　　①Smac、Livin基因以及内参GAPDH RNA引物：均由上海生物工程公司合成，其序列及扩增片段见表1。②总RNA的提取：按Trizol试剂说明书提取总RNA。琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外线分光光度计测定吸光度值以确定RNA浓度和纯度。③cDNA合成：取总RNA 1 μg，dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μL, Random 6 mers(20 μmol/L)1 μL，加超纯水至总体积10 μL，65 ℃ 5 min，冰上骤冷;加入5×Prime Script Buffer 4 μL，Prime Script Rtase0.5 μL，RNAse Ihibitor 0.5 μL(20 U)，超纯水5 μL，30 ℃ 5 min，45 ℃20 min，95 ℃ 5 min，冰上骤冷。④PCR反应及检测：分别取三对引物的上下游引物各0.7 μL,cDNA2.0 μL,TaKaRa Ex Taq HS(5×106 U/L)0.2 μL，10×PCR Buffer Ⅱ 2.0 μL, dNTP Mixture0.8 μL, 加超纯水至总体积20 μL。Smac循环条件：94 ℃预变性1 min;然后94 ℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 45 s，34个循环;最后72 ℃延伸10 min。Livin循环条件：94 ℃预变性1 min;然后94 ℃30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 45 s，37个循环;最后72 ℃延伸10 min。GAPDH循环条件：94 ℃预变性1 min;然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取4 μL PCR产物进行凝胶电泳分析。紫外线灯下检查，与标准相对分子质量Marker比较，确认特异性条带，并用Quantity One分析软件测定密度，以GAPDH基因为内参照，得出目的片段的相对表达量。　　

　1.2.2 ELISA检测Smac和Livin蛋白的表达具体步骤参照试剂盒说明书进行操作。

　　1.2.3 统计学处理方法

　　用SPSS 11.5和PPMS1.51[3]统计软件进行χ2检验和t检验等统计学分析，相关性比较采用Spearman相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 RT-PCR检测

　　Smac和Livin基因mRNA表达见图1。肾癌组织中Smac mRNA的阳性表达率为79.6%(39/49)，正常肾组织中均检测到Smac mRNA的表达;Livin mRNA在肾癌组织和正常肾组织阳性表达率分别为85.7%(42/49)和20.0%(4/20)。Smac和 Livin mRNA在肾癌和正常肾组织阳性表达率差别均有统计学意义(χ2=5.929、27.600，P<0.05)。

　　2.2 ELISA检测

　　Smac蛋白在肾癌组织中阳性表达率为75.5%(37/49)，正常肾组织中均检测到Smac蛋白表达;Livin蛋白在肾癌组织和正常肾组织中阳性表达率分别为81.6%(40/49)和20.0%(4/20)。Smac和 Livin 蛋白在肾癌组织和正常肾组织阳性表达率差别均有统计学意义(χ2=6.538、23.351，P<0.05)。Smac蛋白在肾癌和正常肾组织中表达水平为(0.623±0.201)和(0.894±0.139)kU/g，两者比较差异有统计学意义(t=2.648，P<0.05);Livin蛋白在肾癌和正常肾组织中表达水平为(0.798±0.231)和(0.476±0.106)kU/g，两者比较差异亦有统计学意义(t=2.510，P<0.05)。

　　2.3 肾癌组织中Smac、Livin mRNA表达与临床病理参数关系

　　Smac mRNA表达与肾癌组织的分化程度、临床分期和淋巴结转移均有关(χ2=16.318、14.428、14.072，P<0.05)，分化程度越低、分期越高和有淋巴结转移者表达水平低。Livin mRNA表达与肾癌组织的临床分期和淋巴结转移也有关(χ2=4.218、4.075，P<0.05)，分期越高和有淋巴结转移者表达水平高;与癌组织分化程度无关，但表达水平随分化程度降低而升高。肾癌组织中Smac及Livin mRNA表达与临床病理参数关系　　

　 2.4 肾癌组织中Smac 与Livin表达的关系

　　Smac与Livin在肾癌组织中的表达水平呈明显的负相关性(r=-0.39，P<0.05)。

　　3 讨论

　　肾癌是常见的泌尿系肿瘤，约占成人肿瘤的2%～3%。肾癌的发病率以平均每年2.5%的速度增加，早期症状多不明显，20%～30%的病人就诊时已有远处转移，早期病人行肾癌根治术后有20%～40%会发生远处转移。伴有转移的肾癌5年生存率只有0～13%，肾癌对放疗或者化疗均不敏感[4]。一旦肿瘤发生了转移，治疗方法就变得十分有限。因此，对肾癌的早期诊断和探索特异性治疗方法显得尤为重要。

　　Livin是由3个科研小组在2000年几乎同时发现的IAP家族新成员，人类的livin 基因定位于染色体20q13,全长1 297 nt, 其抑制细胞凋亡的作用机制主要是通过BIR 区与胱天蛋白酶结合，抑制胱天蛋白酶的活性，尤其是抑制胱天蛋白酶-3、7、9的活性，达到阻断凋亡受体和以线粒体为基础的凋亡途径而起作用[5]。Smac也是在2000年首次被报道的一种促凋亡蛋白，主要分布在细胞线粒体中，是线粒体内除细胞色素C外激活胱天蛋白酶的第2个因子，其相对分子质量约为26 000。当线粒体受到凋亡信号的刺激时，有活性的Smac蛋白释放入细胞质，与多种IAP结合，消除了IAP对胱天蛋白酶-3、7、9的阻滞作用，激活胱天蛋白酶而促进凋亡[2]。Smac基因还可以通过诱导胱天蛋白酶-3前酶的活性及增加成熟胱天蛋白酶-3酶活性促进细胞凋亡。有研究表明，IAP成员高表达于人体多种肿瘤组织，且阳性表达率与疾病的发展、预后等密切相关[6]，但IAP最新成员Livin和Smac在肾癌中表达及两者关系未见报道。

　　本研究结果显示，Smac在正常肾组织、肾癌组织中阳性表达率差异具有统计学意义(P<0.05)，且表达量随着肿瘤的发展逐渐降低;Livin在正常肾组织、肾癌组织中阳性表达率差异亦具有统计学意义(P<0.05)，且表达量随着肿瘤的发展逐渐升高。上述研究结果与有关文献报道基本一致[7,8]。本文结果亦显示，肾癌组织中Smac与Livin 的表达呈显著负相关，Smac 阳性表达组的Livin 表达率较Smac 阴性表达组低，这一结果提示Smac对Livin 表达可能是负反馈调节, Smac 表达减少直接或间接引起Livin 的表达升高，减少细胞的凋亡，从而促进肿瘤的发生、发展及恶性增殖，两者关系可能是肾癌细胞凋亡信号传导网络中的重要一环。

　　综上所述,Smac在肾癌组织中表达明显下降,它的降低通过直接或间接影响 Livin 的活性从而降低肾癌细胞凋亡,并最终促进肾癌细胞的恶性增殖。MCNEISH等[9]曾构建了Smac基因的腺病毒载体Ad CMV-Smac，并用该病毒去转染卵巢癌细胞，结果显示，癌细胞的凋亡也增加。上述结果进一步表明，Smac在肿瘤细胞的表达水平与肿瘤细胞的凋亡有关,因此 Smac 可作为肿瘤治疗的一个新靶点。

　　【参考文献】

　　1]THOMPSON C B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995,267(10):1456-1462.

　　[2]WU G, CHAI J, SUBER T L, et al. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO[J]. Nature, 2000,408:1008-1213.

　　[3]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志， 2009,24(1):29-32.

　　[4]吴阶平. 吴阶平泌尿外科学[M]. 济南: 山东科学技术出版社,2004:889-917.

　　[5]KOSOF G M, GOMES B C. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J]. J Biol Chem, 2001,276(5):3238-3246.

　　[6]王东升,周岩冰,王海波. Survivin及P53蛋白在胃癌组织中表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4):302-303.

　　[7]MIZUTANI Y, NAKANISHI H, YAMANOTO K, et al. Down-regulation of Smac/DIABLO expression in renal cell carcinoma and prognostic significance [J]. J Clin Oncol, 2005,23(3):448-454.

　　[8]CRNKOVIC-MERTENS I, WAGENER N, SEMZOW J, et al. Targeted inhibition of Livin resensitizes renal cancer cells towards apoptosis[J]. Cell Mol Life Sci, 2007,64(9):1137-1344.

　　[9]MCNEISH IA, BELL S, MCKAY T, et al. Expression of Smac/DIABLO in ovarian carcinoma cells induces apoprosis via a caspase-9-mediated pathway[J]. Exp Cell Res, 2003,286:186-198.