实验动物尿路结石的体内外模型

　　作者：彭婕，孙西钊，葛卫红，方 芸 作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院：1. 临床药学室;2. 泌尿外科，江苏南京 210008

　　【关键词】 实验动物 尿路结石 模型

　　尿石症(urinary calculus)是一种常见的泌尿系统疾病，是肾、输尿管、膀胱及尿道结石的总称。在过去的20年中，尿石症的发病率逐年上升[12]。尿石症引起的病理损害主要有直接损害、梗阻和感染，三者互为因果，促使病变发展，最终破坏肾组织，损害肾功能，甚至造成肾功能衰竭。因此，尿石症是一种严重危害人类健康的常见病、多发病。

　　随着对尿石症研究的深入，各种利用实验动物的体内和体外尿石模型也逐渐发展起来。尿石实验模型不但可以深入了解尿石的形成过程和机理，而且可以筛选抗尿路结石的中西药物，确认其药理作用和机制。因此，设计和建立尿路结石的动物及体外模型，无疑为探讨尿路结石的发病机理、寻找有效防治尿路结石的药物奠定良好的基础。

　　1 食饵性尿路结石的动物模型

　　尿路结石中最常见的是含钙结石(作为草酸盐或磷酸盐沉淀)，占尿石症的75%～85%，而草酸钙结石又占含钙结石的92%[35]。因此，草酸钙结石模型是最常用、也是研究最为广泛的动物结石模型。草酸钙结石动物模型按病因可分为高钙尿、高草酸尿、维生素缺乏等。从使用动物的种属上分，有大鼠和小鼠模型。

　　1.1 草酸钙结石模型 草酸钙结石动物模型常以乙二醇为诱石剂。乙二醇是草酸的前体物质，在体内可转化为草酸，从肾脏分泌排泄，辅以氯化铵酸化尿液，有利于草酸钙结晶。

　　1.1.1 大鼠草酸钙结石模型 De Water等[6]用0.5%、0.75%、1.0%、1.5%等不同剂量的乙二醇作为诱石剂，发现0.5%剂量组大鼠肾组织几乎无晶体形成，而其他组草酸钙沉积显著增加，故认为乙二醇饮水诱石最低浓度应为0.75%。Pragasam V[7]和Marengo SR[8]亦使用0.75%乙二醇饮水分别于28d和8周成功建立了大鼠草酸钙结石模型。

　　有研究用0.12mL 5%乙二醇灌胃4周和0.12mL 5%乙二醇+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃共4周做比较，发现前组大鼠无草酸钙晶体沉积，即使延长到10～12周，虽然髓质有大量晶体，但集合管仍极少有晶体。而0.12mL 5%乙二醇+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3组成石效果非常明显[9]。日本学者用0.12mL 5%乙二醇+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃，3周后尿草酸和钙的排泄即显著增加，肾脏有草酸钙结石形成，成石率可达81%[10]。

　　曹正国等[11]用以下12种草酸钙模型进行了比较研究：①0.75%乙二醇自来水饮水(饲养28d);②1%乙二醇饮水+2%氯化铵灌胃2mL/只(28d);③1%乙二醇饮水+ 0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃(28d);④1%乙二醇饮水+10%葡萄糖酸钙1.5mL腹腔注射(10d);⑤1%乙二醇饮水+0.25%L羟脯氨酸2.5g/kg腹腔注射(7d);⑥1%乙二醇饮水+ 硫酸庆大霉素40mg/kg皮下注射(7d);⑦10%葡萄糖酸钙1.5mL腹腔注射(10d);⑧3%草酸铵2mL/d灌胃+硫酸庆大霉素40mg/kg皮下注射(10d);⑨3%草酸铵2mL/d灌胃+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃(14d);⑩ 3%草酸铵2mL/d灌胃+10%葡萄糖酸钙1.5mL腹腔注射(10d);1%草酸25mg/kg腹腔注射(14d);1%草酸25mg/kg+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃(14d)。这些模型的共同特点即通过给予大鼠草酸或草酸前体，增加尿草酸排泄，同时辅以其他诱石剂如高钙饮食、VitD饮食、大量抗生素等，以促使大鼠形成肾结石。研究结果显示1%乙二醇+0.5μg 1,25(OH)2 VitD3隔天灌胃(28d)和1%乙二醇+2%氯化铵灌胃2mL/只(28d)诱导的模型组大鼠尿草酸、尿钙均分别明显高于空白对照组和其他模型组，肾组织有大量的草酸钙晶体沉积，诱导的结石最显著、稳定。

　　由上可见，单用乙二醇不易造成大鼠草酸钙模型。而口服乙二醇合并氯化铵可使造模的成功率大大提高。使用的乙二醇浓度应在0.5%以上，多在大鼠饮水中添加1%的乙二醇。氯化铵可酸化尿液，有助于结石形成，但由于其刺激性气味，加入饮水中后大鼠会拒饮，用灌胃给药的方法较好。在使用乙二醇合并氯化铵造模的同时，予大鼠皮下注射或灌胃VitD3或1,25(OH)2 VitD3(VitD3的活性形式)，可加快造模速度、增强造模效果。

　　1.1.2 小鼠草酸钙结石模型 邓耀良等[12]以1%氯化铵+1%乙二醇饮水，标准颗粒饲料饲养昆明种雄性小鼠，3周后小鼠肾组织有多数结晶形成，结晶主要分布在肾乳头，8只中有3只肾盂内有小结石出现。通过该模型观察了芭蕉芯和VitB6对结石生成的作用，发现结石明显减少，个别小鼠结晶出现在肾乳头，肾盂无结石形成。

　　1.2 大鼠对苯二甲酸诱导的膀胱结石模型 朱小南等[13]给幼年SD大鼠饲料中加入5%的苯二甲酸，饲养14d，取肾组织，Von Kossa染色镜检，发现全部大鼠膀胱内均含有大小不等钙化小体，说明膀胱结石模型稳定。

　　2 手术诱发大鼠结石模型

　　2.1 大鼠膀胱出口梗阻模型 计灏烽等[14]应用尿道外口结扎法成功建立大鼠膀胱出口梗阻模型，并诱发膀胱结石。手术方法为：用3%异戊巴比妥钠腹腔内注射(剂量为60mg/kg)麻醉大鼠，用直径1mm的硬膜外麻醉导管蘸少许石蜡油，由大鼠尿道插入至膀胱，再沿尿道外口做“O”字形切口切开皮肤，游离尿道约0.5cm。以导管为支架，用3/0丝线结扎游离的尿道，缝合皮肤，固定导管。对照组仅做插管，切开皮肤，游离尿道，但不结扎尿道。术后5周，大鼠膀胱内有颗粒状或泥沙状结石，膀胱增大，壁增厚。

　　2.2 大鼠植入性膀胱结石模型 钟玲等[15]建立了植入性大鼠膀胱结石模型。大鼠以硫喷妥钠35mg/kg体重腹腔麻醉后，采取下腹正中切口，切开膀胱顶部，植入已消毒的人体膀胱结石圆形碎块一个，术后8周膀胱结石重量增加非常明显，结石在膀胱内伴有泥沙样分布。

　　另有植入性膀胱结石模型为[16]：由尿道感染患者的尿道分离出一种奇异变形杆菌制备成悬浮液。选无特种病原体雌性大白鼠，25mg/kg巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉，在腹部做一耻骨弓上小切口，打开并暴露膀胱，由小切口处插入直径4mm的无菌锌盘至膀胱内。术后7d取奇异变形杆菌悬浮液通过聚乙烯管经尿道接种于膀胱内。感染的膀胱结石可在第5天形成并逐渐增长。形成的结石主要成分为六水磷酸镁铵。

　　在动物的膀胱部植入异物造成膀胱结石模型是常用的手术方式。手术要求在无菌条件下完成，所使用的结石也要求打磨至圆形并消毒，以保证术后大鼠的存活。手术成功后需经过一段时间的饲养(约1～2个月)结石方可见明显增长。

　　3 尿路结石的体外模型

　　3.1 草酸钙结石模型 叶章群等[17]自制了玻璃肾盂，置恒温水浴箱内，其两端连接输入和输出的橡皮管，将从人体取出的多发性结石(表层成分为草酸钙)烘干，在每一肾盂内放置一粒结石。将各患者留置的24h尿分别倾入输液吊瓶内，经莫菲滴管缓缓滴入玻璃肾盂内，再经输出管流入尿壶内，此装置能使每一患者留置的尿液缓慢流经玻璃肾盂，与相应的结石接触反应，使尿液流速控制在30滴/min，水浴温度控制在37℃。患者24h尿中加入防腐剂麝香草酚100mg以防止细菌感染尿液。该模型模拟人体内尿石生长1个月后，结石有不同程度的增长。模型装置见图1、图2。

　　英国学者Karyee Chow等[18]使用的方法与叶章群相似，不同之处在于以人工尿液(或人工尿液加结石患者的尿液蛋白大分子)代替了结石患者的尿液，用来冲刷从人体取出的结石，32d后结石可由100mg增长到250mg。

　　美国学者Atmani F等[19]利用体外模型从全尿结晶、成核、结晶聚集三方面考察了植物Herniaria hirsute 对草酸钙结晶的抑制作用。体外模型的具体做法如下：①全尿结晶分析：收集24h尿液，叠氮钠防腐，取2mL尿液于37℃温孵，加入不同浓度的植物提取液50μL(植物提取液以6～8kD半透膜相4℃对水透析过夜，然后以0.45μm微孔滤膜滤过)，对照不加提取液。最后加入50μL 0.1mol/L草酸钠溶液37℃温孵30min。以扫描电镜观察结晶大小。②成核分析：用0.05mol/L Tris+0.15mol/L NaCl(pH 6.5)缓冲液分别配制3mmol/L CaCl2溶液和0.5mmol/L草酸钠溶液，以0.22μm微孔滤膜滤过。取950μL CaCl2溶液加入不同浓度植物提取液各100μL，加入950μL草酸钠溶液激发结晶反应。终溶液用PTFE覆膜的搅拌棒以800r/min速度进行磁力搅拌，温度始终维持37℃。成核速率以比较加药组与对照组的诱导时间(从诱导开始到结晶光学可见的时间)来估算。③结晶聚集分析：50mmol/L CaCl2溶液和50mmol/L草酸钠溶液分别在60℃水浴中预热1h，然后冷却到37℃混合，过夜，以制备一水草酸钙结晶。混合溶液离心，37℃挥发干水分，得到一水草酸钙晶种。以0.05mol/L Tris+0.15mol/L NaCl(pH 6.5)缓冲液配制0.8mg/mL一水草酸钙晶种，37℃磁力搅拌，加入植物提取液，对照为不加植物提取液，比较二者浊度变化的斜率，计算聚集速率。

　　综上所述，尿路草酸钙结石体外模型的建立方法多为2种：①利用取自结石患者的多发草酸钙结石，以防腐后的尿液或人工尿液冲刷使其生长，再考察药物对结石生长的抑制作用。该模型要求结石为同一患者的多发结石，研究对象为自身对照，即结石和所用尿液来自同一患者，还要求结石成分和表面光滑度基本一致。因此，此模型适宜于筛选尿石的抑制药物。②在尿液或溶液加入草酸根离子或钙离子，使其中的草酸钙达到饱和后自然沉积下来形成结晶，以考察结晶的成核、聚集速率，适用于药物防石机制的研究。

　　3.2 尿酸结石模型 尿液中加入尿酸，使尿液pH值分别为5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加热900℃，10min，使尿液呈过饱和状态，过滤，渐冷却。尿液内预先加入防腐剂或抗生素，约1周后pH值为6.0和6.5的可出现二水尿酸结石;1～4周后 pH值为7.0和7.5的出现尿酸钙结石。尿液内未加防腐剂或抗生素的，2～3d尿液就会出现细菌感染，分解尿素，产生大量的铵离子，形成磷酸镁铵结石和尿酸结石[20]。

　　综上所述，尿路结石的模型多种多样。在动物实验中，通常选用大鼠或小鼠，通过不同的造模方法，可形成不同成分、不同部位的结石。由于人体70%以上的结石以草酸钙及其他钙盐为主要成分，因此动物的结石模型中，草酸钙结石模型是研究最成熟、利用最为广泛的模型。该模型往往通过给予草酸前体，使之在体内代谢最终转化为草酸由尿排出。形成的草酸钙结石多数分布在肾乳头、髓质、皮质等部位[21]。动物的膀胱结石模型主要为人源的植入性结石。在设计动物的结石模型时，还应充分考虑到不同性别、年龄、体重、种属、洁净等级的动物，在造模的方式、剂量、过程上可能有所不同;外界环境如气候、温度、湿度、噪音等也可能对模型的成功率有一定影响。这些因素应予以充分考虑。

　　在建立结石的体外模型时，得到的结果与体内过程必定存在差异，体外模拟的结果只有经过系统的动物实验才能为临床提供理论依据。但体外模拟摒除了动物自身带来的个体差异，适用于药物筛选和作用机制的研究。

　　总之，如何预防尿路结石的形成，防止其复发，是亟待解决的问题。尿路结石的动物模型是研究尿石症发病和筛选防石药物必不可少的手段。这一方面的研究有待医学、药学、动物学、化学等各学科学者的共同努力。

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