神经生长因子对单眼剥夺大鼠外侧膝状体nNOS表达的影响

　　作者：苏鸣 刘丽 陈璐 张亚娟 任生刚 滑惠兰

　　作者单位：050031 石家庄市，河北省儿童医院(苏鸣,陈璐,任生刚,滑惠兰);河北医科大学2005级硕士研究生(刘丽、张亚娟)

　　【摘要】 目的 观察单眼剥夺大鼠神经生长因子(nerve growth factor, NGF)治疗前后外侧膝状体背核(dorsal lateral geniculate nucleus, dLGN)神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)阳性神经元表达的改变。方法 健康雄性SD大鼠，随机分为正常组(N)、单眼剥夺组(MD)、单眼剥夺脑室内注射NGF组(MD+NGF)和注射生理盐水组(MD+NS)，每组随机分为2个亚组。剥夺自14 d龄开始，分别于28、42 d龄处死，脑室注射分别于14、28 d龄开始。采用SABC免疫组织化学染色法观察dLGN nNOS阳性神经元的表达。结果 nNOS阳性神经元在 dLGN散在分布，单眼剥夺和年龄增长可致其阳性神经元数密度降低。N组及MD+NGF组分别与MD组和MD+NS组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。42 d龄处死大鼠dLGN阳性神经元数密度N组与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4组42 d龄与28 d龄比较，dLGN阳性神经元数密度均有显著下降(P<0.05)。结论 视觉发育具有可塑性，弱视治疗具有时效性。在视觉发育敏感期内，外源性提供NGF，可以促进dLGN nNOS增多，从而拮抗剥夺效应。

　　【关键词】 神经生长因子 神经型一氧化氮合酶 外侧膝状体 单眼剥夺 大鼠

　　Effect of NGF on the expression of nNOS in lateral geniculate nucleus of monocular deprived rats

　　SU Ming*, LIU Li, CHEN Lu*, et al.

　　*Department of Ophthalmology, The Children’s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of NGF on the expression of nNOS in dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) of monocular deprived rats. Methods The healthy male SD rats were randomly divided into four groups: normal group (N), monocular deprivation group (MD) and monocular deprivation combined with intraventricular injection of βNGF group (MD+NGF) or NS group (MD+NS). The rats were deprived in left eyes, beginning from postnatal day 14. Each group was divided into two subgroups, in which the rats were killed at postnatal day 28 (subgroup 1) and 42 (subgroup 2) respectively. The intubation tube in right ventricule was performed at postnatal day 14 in the last two groups, in which injections(2 μl) were given for 2 weeks, and the subgroup 1 was injected beginning from postnatal day 14 and the subgroup 2 was injected beginning from postnatal day 28. By using the antinNOS polycloned antibodies immunocytochemical staining, the changes of numberal density of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) positive neurons in dLGN were studied. Results The nNOS immunopositive neurons appeared brown colour were scattered in dLGN. The numberal density of immunopositive neurons decreased along with age and by MD. It increased in MD+NGF subgroup 1 comparing with MD group, and so does in N group. But the same situation were not seen in MD+NGF subgroup 2. Conclusion The visual development is fictile and the therapy to amplyopia have chronergy. In sensitive period of visual development, the ectogenic NGF was effective in preventing the effect of monocular deprivation in rat through the increased nNOS in dLGN.

　　【Key words】 nerve growth factor; neuronal nitric oxide synthase; lateral geniculate nucleus; monocular deprivation; rats

　　视觉发育关键期单眼遮盖会造成剥夺眼投射侧外侧膝状体及视皮质区域缩小，视皮质神经元的眼优势柱向非剥夺眼转移，这种发育的影响导致剥夺眼视锐度及对比敏感度下降，从而形成弱视[1，2]。本实验应用SABC免疫组织化学方法观察神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对单眼剥夺大鼠外侧膝状体背核(dorsal lateral geniculate nucleus, dLGN)、神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)阳性神经元数密度的影响，进一步明确NGF对弱视的逆转作用，探讨其作为弱视治疗药物的可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 14 d龄健康雄性大鼠64只，大鼠及用于饲养的普通动物室由河北医学科学院提供。随机分为4组：正常组(N组)和单眼剥夺组(MD组)各12只，单眼剥夺脑室内注射NGF组(MD+NS组)和单眼剥夺脑室内注射生理盐水组(MD+NGF组)各20只。自14 d龄开始行单侧眼睑缝合术制作单眼剥夺模型，每组随机分为2个亚组，分别在28和42 d龄处死。后2组中2个亚组分别在14和28 d龄开始脑室注射NGF或生理盐水。βNGF由中国军事医学科学院基础医学研究所提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 单侧眼睑缝合和侧脑室插管动物模型手术制作：乙醚吸入麻醉下行左眼眼睑上下睑缘各0.5 cm切除缝合术。戊巴比妥钠腹腔麻醉后，固定于脑立体定位仪上，按Paxinos大鼠脑立体定位图谱，在手术显微镜下按坐标位置进行右侧侧脑室插管并留置固定。每天注射NGF或生理盐水1次，每次2 μl。

　　1.2.2 切片及染色：实验动物分别养至28和42 d龄时处死并灌注固定，修取视交叉至乳头体段脑块，在左侧脑干下方用剃须刀片切矢状线做标记，以区分左右两侧。连续冠状冰冻切片贯穿整个外侧膝状体，厚度40 μm。切片使用抗nNOS多克隆抗体进行免疫细胞化学染色。

　　1.2.3 光镜下观察并计算机图像分析：在Olympus光学显微镜及IPP图像采集系统的×100倍光视野下，测量nNOS阳性神经元在右侧dLGN的数目。数密度用免疫阳性细胞数/切片核团面积表示。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 nNOS阳性神经元在dLGN散在分布，多为短轴突双极细胞，呈浅褐色着染。

　　2.2 28 d龄处死大鼠dLGN阳性神经元数密度N组及MD+NGF组分别与MD组和MD+NS组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。42 d龄处死大鼠dLGN阳性神经元数密度N组与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4组42 d龄与28 d龄比较，dLGN阳性神经元数密度均有显著下降(P<0.05)。见表1。

　　表1 28和42 d龄大鼠dLGN nNOS阳性神经元数密度(略)

　　注：与N组比较，*P<0.05;与MD组比较，#P<0.05;与MD+NGF组比较，△P<0.05;与28 d龄比较，☆P<0.05

　　3 讨论

　　3.1 一氧化氮(NO)对视觉系统发育及可塑性的影响 NO神经元调节局部突触联系效率，导向突触生长，调节视觉的适应、嗅觉气味区分和痛觉的信号传递，参与行为和学习记忆[3]。NO作为一种神经递质和神经调质，它在视觉发育及视信息的形成、整合和传递中起重要作用，NOS通过调节NO的生成参与这一过程。在nNOS基因表达缺陷的大鼠，从视网膜到视皮质整个视路的发育成熟过程明显延迟，并且视投射紊乱[4]。本实验MD组大鼠剥夺眼对侧dLGN nNOS阳性神经元数密度降低，显示在其视觉发育关键期(生后14～45 d)缝合一眼引起NO合成减少，出现明显的弱视效应，进一步证实NO是视觉发育环路中不可或缺的一环。实验还发现各组42 d龄大鼠较28 d龄大鼠dLGN nNOS阳性神经元数密度均显著降低，说明随着日龄增加，dLGN神经元进一步精细化，可塑性降低。

　　3.2 NGF对视觉系统发育及可塑性的影响 NGF属于神经营养因子家族，具有调制神经系统突触发育可塑性效应。实验证明在异常的视觉环境中，NGF通过与相应受体结合，明显促进神经细胞及轴突生长、遏制其凋亡[5，6]。NGF具有活动依赖性，正常的视觉经验可以促进视中枢NGF的产生与释放，是关键期神经元突触活动加强的结果;单眼剥夺后剥夺眼驱动的神经元突触电活动减少，引起突触后膜神经营养因子释放减少，结果剥夺眼驱动的神经元萎缩、变性，形成弱视效应;而外源性NGF可以稳定视皮质神经元的眼优势，阻止双眼驱动神经元的减少，从而阻止视力丧失[7]。而在视觉敏感期内应用NGF抗体则可延迟视觉系统突触的发育，推测在敏感期内NGF是在双眼竞争中稳定外侧膝状体-视皮质连接功能的关键因子。

　　本实验MD+NGF组28 d龄处死大鼠，dLGN nNOS阳性神经元数量与同龄正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，证实外源性给予NGF有效地阻止了剥夺性弱视发生，其作为弱视治疗的可行药物有进一步研究的意义。另外42 d龄处死大鼠dLGN nNOS阳性神经元数量，MD+NGF组与MD组比较差异无统计学意义(P>0.05)，两者与同龄N组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，显示MD+NGF组的2个亚组虽然同时发生单眼剥夺，但晚期给予外源性NGF无明显弱视逆转作用。而早期给予NGF能有效逆转弱视效应，可能与NGF治疗时机与NOS发育时程相符、治疗前弱视持续时间相对短暂、可塑性好等因素有关。

　　【参考文献】

　　1 Prusky GT, Douglas RM. Developmental plasticity of mouse visual acuity. Eur J Neurosci, 2003,17: 167173.

　　2 Hubel DH, Wiesel TN. Receptive fields binocular interaction and functional architecture in the cat's visual cortex. J Physoil, 1962,160: 106154.

　　3 巴里·史密斯, 乔治·阿德尔曼主编. 神经科学百科全书(续编). 第1版.上海: 上海科学技术出版社,2000.289292.

　　4 Huang PL, Lo EH. Genetic analysis of NOS isoforms using nNOS and eNOS knockout animals. Prog Brain Res,1998,118:1325.

　　5 Hannila SS, Kawaja MD. Nerve growth factormediated collateral sprouting of central sensory axons into deafferentated regions of the dorsal horn is enhanced in the absence of the p75 neurotrophin in receptor.J Comp Neurol,2005,486:331343.

　　6 蒋永祥, 郭希让, 鲍玉洲, 等. 神经生长因子对视网膜脱离视细胞保护作用的实验研究. 眼科研究， 2004, 22: 132135.

　　7 Pizzorusso T, Fagiolini M, Fabris M, et al. Schwann cells transplanted in the lateral ventricles prevent the functional and anatomical effects of monocular deprivation in the rat. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:25722576.