端粒酶PCR SCE检测对诊断膀胱癌的价值及应用

　　作者：胡金钟 汪定海 傅祝能 单小云 徐瑞龙 作者单位：321000 浙江省金华市中心医院

　　【摘要】 目的 探明膀胱癌患者端粒酶阳性率及姊妹染色单体互换(SCE)率，以确定其诊断及应用价值。 方法 采用膀胱癌及对照正常膀胱的组织进行端粒酶活性检测(TRAP-银染法)、外周血淋巴细胞SCE检测，然后进行比较分析。 结果 (1)组织标本的端粒酶阳性率：膀胱癌93.75%(30/32)，正常膀胱组织0%(0/30)，表明膀胱癌端粒酶高度表达，其与正常对照组比较差异有显著性(P<0.001)。(2)外周血淋巴细胞SCE率(X)：膀胱癌32例(10.06)，膀胱癌的SCE率均显著高于正常对照组(P<0.001);(3)膀胱癌患者的端粒酶活性与SCE率的关系：阳性组32例SCE率10.06;膀胱癌患者端粒酶阴性组30例SCE率9.17(P<0.05)。 结论 端粒酶PCR及SCE检测对于膀胱癌诊断及鉴别良恶性均具有重要的价值，可作为辅助诊断及鉴别诊断指标，SCE率可作为膀胱肿瘤的疗效评价指标。

　　【关键词】 端粒酶 SCE 膀胱癌

　　【Abstract】 Objective To assay the positive rate of telomerase and SCE rate in patients of bladder cancer therefore to evaluate its clinical value in diagnosis. Methods To assay the positive rate of telomerase in the specimen of bladder cancer and that in the normal control (TRAP- argentation)and SCE of peripheral blood lymphocytes, figures will be recorded 、analyzed and compared . Results (1). the positive rate of telomerase was 93.75% (30/32)in specimen of bladder cancer and 0%(0/30)in specimen of normal bladder ,the difference was significant (P<0.001).(2). The SCE rate of blood lymphocytes in prostate bladder cancer(10.06.) was significantly higher than that in normal control ; (3).There were no notable correlation between SCE rate and activity of telomerase. The SCE rate of the telomerase positive rate specimen(30 cases) was 10.06 ,which was significantly higher than that of telomerase negative specimen (30 cases) ( SCE rate was 9.17 ) (p<0.05). Conclusion The PCR of telomerase and SCE test have important value in diagnosis of bladder cancer and differential diagnosis between malignant and benign tumor. They may be used as index of diagnosis and differential diagnosis. SCE can also be used as index to estimate the curative effect of bladder tumors.

　　【Key words】 telomerase sister chromatid exchange(SCE) bladder cancer

　　自1994年Kin等[1]报道了端粒酶重复片段扩增法(TRAP)以来，国内外对各种恶性肿瘤细胞端粒酶的研究骤增，但膀胱癌等的报道相对较少。姊妹染色单体互换(SCE)可作为评价环境化学物质对细胞DNA损伤的敏感指标，文献报道恶性肿瘤患者外周血的淋巴细胞SCE率增高，SCE增高是染色体不稳定的表现，并与肿瘤的发生相关。本资料同时以端粒酶PCR及SCE技术对膀胱癌进行检测，并进行对照比较分析，旨在探讨其对膀胱癌的诊断、鉴别诊断及应用价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　组织标本端粒酶PCR检测选择膀胱癌32例，男22例，女10例;年龄30～91岁，平均62岁。正常对照30例，男20例，女10例;年龄58～80岁，平均60.5岁;SCE检测62例。其中全膀胱切除13例，膀胱部分切除19例;TUR-B 5例，均诊断为移行细胞癌，其中I级5例，II级22例，III级 5例，32例膀胱癌均经临床病理确诊。

　　1.2 方法

　　端粒酶PCR检测(TRAP-银染法)试剂盒由Intergen公司提供。(1)组织标本：离体后取绿豆大小迅速放入1.5ml或0.5ml尖底离心管中，保存于低温(-30℃)状态，取已消毒处理的眼科剪刀，反复剪碎组织呈糊状，每40～100mg的组织用200μl的l× CHAPS Lysis buffer混合置于低温冰箱上保存(-30℃)，1周内完成端粒酶活性测定。(2)TRAP-银染法：按试剂盒说明操作并加以改进。将标本提取液融化后置于2～8℃冰箱内冷藏1h，取出离心10min(12000r/min)，再取上清液2μl置于反应液(48μl)内，并同时进行阳性、阴性、热灭活、引物-二聚体PCR污染等对照;上层覆盖20μl石蜡油后行PCR扩增。30℃30min后按94℃30s，59℃30s两种温度循环33次，取出扩增物进行PCR产物浓缩，加二甲苯青少许，混匀，作聚丙烯酰胺明胶电泳，10～12cm垂直200V、1.5h或直至二甲苯青电泳至胶长度的70%～75%，电泳后进行银染，观察结果后制膜，干燥保存。(3)判断标准：端粒酶阳性标本可看到36bp.S-Ic带及6个碱基增加的阶层带，阴性标本，只能看到36bp.S-Ic带。SCE检测：按常规染色体培养法即每例抽全血2ml，肝素抗凝，取0.3～0.5ml加入5ml 1640培养液内37℃培养24h后加5-溴尿嘧啶核苷(Brdu，德国产)，双盲法计数20个分化清晰的第2周期分裂相，求得SCE细胞的平均值，即为SCE率。

　　2 结果

　　2.1 两组组织标本端粒酶活性检测结果见表1。表1 两组组织标本端粒酶活性检测结果(略)

　　2.2 膀胱癌患者及正常对照组外周血淋巴细胞SCE检测结果见表2。SCE率结果与性别，年龄等无显著相关性，膀胱癌组与正常对照组比较差异有显著性(P<0.001)。表2 两组SCE检测结果(略)

　　2.3 膀胱癌患者端粒酶PCR与SCE率有相关性。膀胱癌32例，端粒酶阳性30例，端粒酶阴性2例，SCE率平均值为10.06;正常对照组30例，端粒酶阴性30例，SCE率平均值为6.37，两组差异有显著性(P<0.05)，表明端粒酶结果与SCE率具有相关性。

　　3 讨论

　　端粒酶PCR和SCE检测是两个独立的实验技术，但它们具有一定的联系，端粒和端粒酶系统是目前肿瘤领域的热门课题[2]，端粒酶与肿瘤的发生发展相关，绝大多数正常人体细胞中无端粒酶活性，而在肿瘤细胞中却特异性地表达[3];同样，SCE率增高与肿瘤的发生也相关，SCE率是一种有价值的潜在致癌的指标。本资料同时以端粒酶和SCE技术对膀胱癌患者进行研究，结果膀胱癌组与正常对照组比较差异有显著性;提示对膀胱癌患者同时进行端粒酶和SCE检测，有助于临床的诊断及鉴别诊断。本研究表明，对恶性肿瘤进行生物治疗，在治疗前后进行SCE的动态观察，可以辅助评判其疗效，膀胱癌患者在治疗后其SCE值下降，即可表明其有效性。文献报道，多类癌患者外周血淋巴细胞自发SCE显著少于正常人[4～6]，膀胱癌也是其中之一。余达贤[6]用SCE及淋巴细胞微率为指标检测了28例恶性肿瘤患者，结果表明恶性肿瘤患者的SCE和淋巴细胞核率反映了两种不同的细胞遗传效应损伤，是染色体不稳定性的表现，而染色体不稳定性是恶性肿瘤的物质基础。本研究发现，膀胱癌患者SCE自发极显著少于正常人(P<0.01)，而术后患者SCE接近于正常，仅高出(1.10±0.63)，这可能与患者恢复时间有关;有3例SCE术后仍高达10.2以上，经1～2年观察，肿瘤复发，而另29例术后未见复发。

　　研究表明：对端粒酶PCR和SCE结果进行比较，其恶性肿瘤患者端粒酶阳性组具有较高的SCE率，与端粒酶阴性组比较差异有显著性(P<0.05)，即提示具有相关性，两项指标均具有鉴别诊断恶性肿瘤的价值，作为辅助诊断手段，SCE率是一种量的指标，在10.06以上要考虑恶性肿瘤的存在，而本资料端粒酶PCR为定性指标，随着研究及医学发展，端粒酶必然是从定性到定量，并走向前景广阔的治疗。

　　基金项目：浙江省金华市自然基金课题 科研计划编号98-1-33。已获2005年金华市科学技术三等奖

　　【参考文献】

　　1 Kin NW, pistyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer. Science, 1994, 266:2001.

　　2 Breslow RA， Shay JW, Gazdar AF, et al. Telomerase and early detection of cancer a National cancer institute workshop.JNCI, 1997, 89:618～625.

　　3 Shay JW, Wright WE. Telomerase activing in human cancer . Current Opinion in Oncology, 1996,8:66～71.

　　4 赵艳青.20个癌高发家族SCE率检测比较.遗传与疾病，1991，8(2):110.

　　5 吴明明.膀胱癌及个体外周血淋巴细胞染色单体时变和姐妹染色单体互换观察.中华泌尿外科杂志，1985，(2)：70～72.

　　6 余达贤，张宏英.SCE结合淋巴细胞微核率对诊断恶性肿瘤的研究.广州医学院学报，1994，22(1):57.