尿纤维连接蛋白在诊断膀胱移行细胞癌中的应用价值

　　作者：凌海滨 赵 莹 李向东 苗文隆 李凤歧 成日青 作者单位：(1.河北北方学院附属第一医院泌尿外科，河北 张家口 075000;2.浙江大学医学院附属第一医院检验科，浙江 杭州 310003)

　　【摘要】 目的： 评价尿纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)在诊断膀胱移行细胞癌中的应用价值，并界定其临床参考值。方法： 采用ELISA法检测55例膀胱移行细胞癌患者、34例其他泌尿系疾病患者及29例正常人的尿Fn含量，并同时测定尿肌酐(Creatin,Cr)，计算Fn/Cr比值，比较各组人群尿Fn和尿Fn/Cr比值之间的差异;分析不同肿瘤分期、分级尿Fn和尿Fn/Cr之间的差异;利用尿Fn/Cr比值与其它尿生物标志物比较它们之间的优势。结果： 膀胱癌组尿Fn含量(583.4±302.5μg/L)、Fn/Cr比值(149.5±93.3mg/mol)与其他泌尿系疾病组Fn含量(209.3±125.0μg/L)、Fn/Cr比值(52.4±36.2mg/mol)以及对照组Fn含量(134.3±83.6μg/L)、Fn/Cr比值(38.2±22.7mg/mol)相比，有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。尿Fn诊断膀胱移行细胞癌的灵敏度和特异度分别为78.2%和76.2%，尿Fn/Cr比值分别为81.8%和79.4%。另外，不同分期、分级膀胱癌患者的尿Fn含量及Fn/Cr比值也有明显差异(P<0.05)。比较后提示尿Fn/Cr比值与目前多种分子生物学指标检测膀胱肿瘤的敏感性、特异性基本相似。结论： 尿Fn含量及尿Fn/Cr比值在膀胱癌的临床诊断方面有重要的价值，是诊断膀胱癌的一种较理想指标;尿Fn含量及Fn/Cr的高低与膀胱癌的分期、分级有关，可大致判断膀胱癌的浸润度和恶性度，并可用于膀胱癌的预后评估，但目前仍不能代替膀胱镜;界定其临床参考值为250μg/L(Fn)和62mg/mol(Fn/Cr)。

　　【关键词】 尿纤维连接蛋白; 尿纤维连接蛋白/尿肌酐比值; 移行细胞癌

　　基金项目：河北省卫生厅医学科学重点研究课题计划项目(编号：06243)

　　The Clinic Applied Value of Urine Fibronectin in Diagnosis of Bladder Transitional Cell Cancer

　　LING Haibin1， ZHAO Ying2， LI Xiangdong1, et al

　　1.Department of Urology,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,

　　Zhangjiakou,075000,Hebei,China;2.The Clinical Laboratory Center of the First Affiliated Hospital

　　of Medicine School,Zhejiang Uiversity,Hangzhou,310003,Zhejiang,China

　　【ABSTRACT】 Objective: To evaluate the clinic applied value of urine fibronectin(Fn)in the patients with bladder transitional cell carcinoma(TCC); to define the optimal cutoff for urinary Fn and Fn/Cr. Methods： Urinary Fn was detected by ELISA technique in 55 cases with bladder transitional cell cancer,34 cases with other urogenital diseases and 29 cases of healthy subjects. Meanwhile the analysis of creatin(Cr)in urine was carried out and the urinary Fn/Cr ratio was calculated. Analysed the discrepancy of urinary Fn and Fn/Cr among three groups and among tumor grades and stages. were analyzed Sensitivity and specificity of the urinary Fn/Cr compared to the other urinary tumor markers cited in the literature,including the urinary cytology. Results：The urinary Fn and Fn/Cr ratios were significantly higher in bladder cancer(Fn 583.4±302.5μg/L,Fn/Cr 149.5±93.3mg/mol)than in other urogenital diseases(Fn 209.3±125.0μg/L,Fn/Cr 52.4±36.2 mg/mol)and the healthy subjects(Fn 134.3±83.6μg/L,Fn/Cr38.2±22.7mg/mol)(P<0.01,P<0.05). The sensitivity and specificity of urinary Fn were 78.2% and 76.2%,respectively in the patients with bladder cancer,while urinary Fn/Cr ratio were 81.8% and 79.4% respectively. Moreover,urinary Fn and Fn/Cr ratio had obvious discrepancy among tumor grades and stages(P<0.05，P<0.05). Otherwise,Sensitivity and specificity of the urinary Fn/Cr were not higher than that of the other urinary tumor markers cited in the literature. Conclusion：Urinary Fn and Fn/Cr ratios have significant diagnostic value in the patients with bladder cancer. Urinary Fn is claimed to be a potential role in the diagnosis and prognosis of bladder cancer. Obvious relationship between urinary Fn and the stages or grades has been noted. Determining urinary Fn values may give an idea about the invasive potential of the tumor and may estimate the prognosis. However,as with the other urinary tumor markers,the test performance was not sufficient to replace cystoscopy. The optimal cutoff was established at 250μg/L for urinary Fn and 62mg/mol for Fn/Cr.

　　【KEY WORDS】 Urinary fibronectin; Urinary fibronectin /urinary creatin value; Bladder transitional cell cancer

　　2007年10月凌海滨等：尿纤维连接蛋白在诊断膀胱移行细胞癌中的应用价值第5期2007年10月河北北方学院学报(医学版)第5期 目前膀胱镜检查及可疑病变处活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准。为寻求无创、简便、准确的诊断方法，研究者们不断地探索。近年来，通过检测尿液中相关的肿瘤标记物作为膀胱肿瘤诊断的方法得到广泛研究，多种无创、简便的分子生物学指标应用于膀胱肿瘤患者尿液的检测，包括核基质蛋白22(NMP22)、膀胱肿瘤抗原(BTA)、存活素(SV)、透明质酸(HA)及透明质酸酶(HAase)、细胞角蛋白(CK)等，在隐匿性和复发性膀胱肿瘤早期诊断和术后随访研究中，取得了令人鼓舞的成果[1～4]。本课题对尿纤维连接蛋白在诊断膀胱癌中的临床价值进行探讨，可望为该病患者的早期诊断及筛选提供新的手段。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　1.1.1 膀胱癌组 55例，均来自我院2005.11～2006.4月泌尿外科住院患者，所有病例均行膀胱镜检查，并经病理切片证实为膀胱移行上皮细胞癌;其中男40例，女15例;年龄33～84岁，平均56.7岁。根据国际抗癌协会(UICC)及美国癌症分期委员会(AJCC)联合制定的分期标准，分为Ta-126例，T218例，T3T411例。病理分级分为G117例，G224例，G314例。

　　1.1.2 其他泌尿系统疾病组 34例，均来自我院2005.11～2006.4月泌尿外科住院患者。男20例，女14例;年龄28～81岁，平均52.1岁。其中①良性泌尿系统疾病23例，其中前列腺增生7例，膀胱炎3例，肾/输尿管/膀胱结石5例，肾结核4例，肾囊肿2例，尿路感染2例。②其它泌尿生殖系肿瘤11例，其中前列腺癌3例，肾癌3例，肾盂癌3例，睾丸肿瘤2例。

　　1.1.3 对照组 29例，均来自我院2005.11～2006.4月来我院体检者。所有人均排除泌尿生殖系统相关疾病。男17例，女12例;年龄21～73岁，平均48.3岁。

　　1.2 主要试剂与方法

　　1.2.1 尿Cr的检测试剂由烟台澳斯邦公司提供;

　　Fn检测采用BIO RAD 680全自动酶标仪测定;

　　尿Cr的检测采用Hitachi 7600全自动生化分析仪测定;

　　试剂盒由DR Lab California(USA)提供。

　　1.2.2 Fn检测采用酶联免疫吸附竞争法(ELISA)。

　　1.3 结果测定

　　1.3.1 尿液标本的收集与处理 嘱留尿样者前一天晚上10时后禁水，留取第一次晨尿。分为两份，一份送检验科检测尿Cr，另一份则在离心机3000r/min离心后，收集上清夜，置于干净的试管，封盖，于-80℃保存。

　　1.3.2 实验步骤 严格按照试剂盒说明进行标本检测。

　　1.3.3 尿Fn含量，单位为μg/L;Fn/Cr比值，单位为mg/mol。

　　1.4 统计学方法

　　所有数据在不同多组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 各实验组尿Fn含量、Fn/Cr比值比较

　　膀胱癌组尿Fn含量、尿Fn/Cr比值明显高于其他泌尿系疾病组(P<0.01，P<0.05)和对照组(P<0.01)。表明正常组和其他泌尿系疾病组尿Fn含量和Fn/Cr与肿瘤组间均有显著性差异。其他泌尿系统疾病组和对照组尿Fn含量、尿Fn/Cr比值之间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 三组检测结果的比较注：**与对照比P<0.01;△与其它泌尿系疾病组相比P<0.05;△△与其它泌尿系疾病组相比P<0.01

　　2.2 不同病理分期膀胱癌患者尿Fn和Fn/Cr含量的比较

　　T3-4 期组患者尿Fn、Fn/Cr明显高于Ta-1期患者(P均<0.01)和T2期组患者(P均<0.05)，T2期组患者尿Fn、Fn/Cr明显高于Ta-1期组患者(P均<0.05)。表明随着肿瘤浸润程度的加深，尿Fn和尿Fn/Cr含量明显升高。Fn/Cr对检测膀胱癌不同分期的敏感性也明显提高，见表2及图1。表2 膀胱肿瘤不同分期检测数值的比注：*与Ta-1相比P<0.05;**与Ta-1相比P<0.01;△与T2相比P<0.05

　　G3组患者尿Fn、Fn/Cr明显高于G1组患者(P均<0.01)和G2组患者(P均<0.05)，G2组患者尿Fn、Fn/Cr明显高于G1组患者(P<0.01，P<0.01)。

　　随着肿瘤病理分级的增高，尿Fn含量和尿Fn/Cr明显升高。Fn/Cr对检测膀胱癌不同分级的敏感性也明显提高，见表3及图2。表3 膀胱肿瘤不同分级检测数值的比较注：**与G1相比P<0.01;△与G2相比P<0.05

　　本组实验结果数据与目前多种分子生物学指标检测膀胱肿瘤的敏感性、特异性基本相似，其敏感性仍不是很高，见表4。表4 Fn/Cr与其它生物学指标对膀胱癌总敏感性和总特异性及分级敏感性比较(%)

　　检测方法总敏感性总特异性G1级敏感性G2级敏感性G3级敏感性Fn/Cr81.879.429.47592.9NMP2247～10060～7025～8645～9750～100BTA54～8372～953～5636～5863～100HAHAase86～9284～92869693Survivin64～10075～1006590100Cytology20～4090～1006～4436～6167～100

　　3 讨论

　　Fn是一组结构上类似、免疫原性相同的大分子非胶原糖蛋白，由两个分子量为22万的亚单位组成，主要存在于细胞表面、细胞外液、结缔组织和大多数基底膜中。根据Fn在体内分布不同，分为两种主要类型[5]：血浆型主要以可溶性形式存在于血浆及体液中;细胞型以不溶性形式存在于细胞表面、基底膜和细胞外基质。Fn最重要的功能是促进细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连，具有维持细胞形态、控制细胞迁移、诱导细胞分化和影响免疫细胞功能等多种生物学作用[6]。

　　正常人泌尿系统Fn只存在于尿路上皮基底膜及粘膜下层，在完整的上皮表面基本无表达。尿液中Fn以裂解片段或复合体的形式存在，这些裂解片段或复合体主要是由尿路基底膜蛋白降解而来[7,8]。肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了Fn从基底膜的释放，这样，由于膀胱癌中基底膜Fn不同程度的丧失，故尿液中Fn含量可能因为基底膜中释放增多而上升[9,12]。

　　3.1 尿Fn含量、Fn/Cr与膀胱癌的关系

　　尿液长时间搁置，化学成分及蛋白成分可能会被破坏，Fn的稳定性会降低，故采集一次性尿液立刻处理较收集24h尿更合理[10]。同时，由于尿液的浓缩与稀释有较大的变化，而不同个体间尿液中Cr相对较稳定，因此同一尿样标本的尿Fn/Cr比值更趋于准确及稳定，减少个体间的误差，更能反映个体的实际状况[11]。

　　本实验中膀胱癌组尿Fn含量及Fn/Cr分别是正常组的4.34倍和3.91倍，是其它泌尿系疾病组的2.79倍和2.85倍。表明膀胱癌组尿Fn含量及Fn/Cr与其他两组间有统计学意义(P<0.01)，是诊断膀胱癌有价值的肿瘤标志物。Malmstrom[8]等通过对106例膀胱癌、13例其它泌尿系疾病患者和24例健康人进行尿Fn检测，结果发现膀胱癌组与其它两组Fn含量均有显著性差异(P<0.001)。在以后相继的报道中[10～12]，认为膀胱癌患者尿Fn、Fn/Cr与其它泌尿病变者及健康人有显著差异，可作为膀胱癌的诊断指标，这与我们研究的结果相一致。

　　本实验中肾癌患者尿Fn含量及Fn/Cr均在正常水平，可能与肾癌的细胞起源有关，因而肾癌病人的尿Fn检测仍在正常水平。本组有2例肾盂癌患者Fn含量及Fn/Cr高于正常，可能因为肾盂粘膜亦由移行上皮构成，粘膜下基底膜中Fn同样释放到尿液中所致。在本组研究的7例前列腺增生(BPH)、3例膀胱炎、5例肾/输尿管/膀胱结石和4例肾结核患者中，3例BPH(42.9%)、1例输尿管结石患者(20%)、1例膀胱炎患者(33.3%)和1例肾结核患者(25%)的Fn含量及Fn/Cr均高出正常，这与Menendez[12]等所研究的结果相类似，表明尿Fn可能还与BPH、尿路结石、肾结核等疾病因素存在联系。因本组样本较少，在以后的相关研究中有待进一步揭示。

　　3.2 膀胱癌患者尿Fn和Fn/Cr含量与不同病理分期、分级的关系

　　本实验结果表明，膀胱癌患者尿Fn含量、Fn/Cr随着病期的发展而升高。在浸润性膀胱癌患者中尿Fn、Fn/Cr明显高于浅表性膀胱癌患者，而且随病理分级的升高尿Fn含量由206.8μg/L升至694.3μg/L，Fn/Cr也由56.3mg/mol升高到196.2mg/mol。说明膀胱癌患者尿Fn含量、Fn/Cr与肿瘤的分期、分级密切相关，这与文献报道一致[10～12]。基底膜是阻止癌细胞侵犯邻近组织的屏障，当粘膜上皮癌变随着肿瘤浸润程度的不断加深，肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了Fn从基底膜的释放，膀胱基底膜中Fn减少、消失或脱落，从而释放到尿液中。由于Fn参与细胞—细胞、细胞—基质的粘附，一旦基质中的Fn减少，可导致肿瘤细胞的游离，而肿瘤细胞游离到瘤体以外是肿瘤浸润转移的前提[13]。有资料表明膀胱移行上皮细胞癌的浸润程度与预后有关，浅表性膀胱癌80%出现局部复发，但转移率低于10%，而浸润性膀胱癌除表现对肌层的浸润外，更危险的是远处转移。因而尿Fn、Fn/Cr不仅可估测膀胱癌的恶性程度及进展，也可作为膀胱癌患者预后评估的有效指标。

　　3.3 尿Fn在检测膀胱肿瘤生物标记物中的地位及参考值

　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见肿瘤且易复发，表浅膀胱肿瘤患者术后复发率高达70%，有30%可发展成为浸润性肿瘤。到目前为止，还没有能很好地判断膀胱肿瘤术后是否早期复发或是发展成为浸润性肿瘤的方法。临床医生一直在寻找一种可定量的简便方法来替代膀胱镜和尿细胞学检查。

　　Mutul[11]等对多种膀胱肿瘤标记物进行了总结(表4)，根据我们所测定的结果，发现Fn/Cr的敏感性和特异性与其它标志物类似，在诊断方面并无特殊优势。但可以肯定的是，对浸润性膀胱癌和低分化膀胱癌，尿Fn和Fn/Cr有着很高的敏感性和特异性，是评价膀胱癌恶性度和进展以及估测预后的敏感指标。

　　通过本实验尿Fn和Fn/Cr阳性率的比较也可以看出，经过尿肌酐的纠正，Fn/Cr检测膀胱癌的敏感性和特异性均有所增高。但亦有资料显示[10]，在纠正前尿Fn和Fn/Cr的敏感性和特异性分别为80%和74.7%，纠正后为70%和84.9%，纠正后特异性增高，而敏感性降低。我们考虑出现此结果可能是与不同个体差异，尤其是与肾功能有关。故建议检测膀胱癌应该尿Fn含量和Fn/Cr同时进行分析。

　　近三年来尿Fn在临床应用的文献报道较少，我们认为，尿Fn标准值的不一致性可能是各个实验组中肿瘤患者占有的比例差异较大所致，使得尿Fn、Fn/Cr在临床的应用受到限制。本实验以250μg/L和62mg/mol为尿Fn含量和Fn/Cr的临界值，测得敏感性及特异性分别为78.2%、76.2%和81.8%、79.4%。结合有关文献，我们分析了假阳性的构成，通常出现在以下几种情况：(1)BPH和前列腺癌;(2)尿石症;(3)泌尿系感染和性病;(4)肾小球及肾小管慢性病变;(5)膀胱癌术后膀胱灌注患者;(6)其它泌尿系癌。本实验也证实了以上报道。因此，临床上在应用尿Fn诊断膀胱癌时须注意鉴别。

　　【参考文献】

　　1 Lokesshwar VB,Schroeder GL,Selzer MQ,et al. Bladder tumor markers for monitoring recurrence and sceening comparison of hyaluronic acidhyalurinodase and BAT state tests[J]. Cancer,2002,95(10):6172

　　2 Zippe C,Pandrangi L,Potts JM,et al.NMP 22: a sensitive,costeffective test in patients at risk for bladder cancer[J].J Urol,1999,161:6265

　　3 Ho SM,Cheng RY.A promising bladder cancer detection assay the HAHAase test[J].J Urol,2004,172(3):11231126

　　4 Shariat SF,Casella R,Khoddami SM,et al.Urine detection of survivin is a sensitive marker for the noninvasive diagnosis of bladder cancer[J].J Urol,2004,171:626630

　　5 Kosmehl H,Berndt A,Katenkamp D. Molecular variants of fibronectin and laminin:structure,physiological occurrence and histopatological aspects[J].Virch Arch,1996,429:311322

　　6 Potc JR,Campbell ID. 1996:Structure and function of fibronectin modules[J]. Matrix Bio,1996,15: 313320

　　7 Katayama M,Kamihagi K,Nakagawa K,et al.Increased fragmentation of urinary fibronectin in cancer patients detected by immunoenzymometric assay using domainspecific monoclonal antibodies[J].Clin Chim Acta,1993,217:115128

　　8 Malmstrom PU,Larsson A,Johansson S.Urinary fibronetin in diagnosis and followup of patients with urinary bladder cancer[J].Br J Urol,1993,72:307310

　　9 Redwood SM,Liu BC,Weiss RE,et al.Abrogation of the invasion of human bladder tumor cells by using protease inhibitor[J].Cancer,1992,69:12121219

　　10SanchezCarbayo M,Urrutia M,Gonzalez de Buitrago JM,et al.Evaluation of two new urinary tumor markers:bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer[J].Clin Cancer Res,2000,6:35853594

　　11Mutul N,Turkerl L,Emerk K.Analytical and clinical evaluation of a new urinary tumor marker:bladder tumor fibronectin in diagnosis and followup of bladder cancer[J]. Clin Chem Lab Med,2003,41(8):10691074

　　12Menendez V,FernandezSuarez A,Galan JA,et al.Diagnosis of bladder cancer by analysis of urinary fibronectin[J].Urology,2005,65(2):284289

　　13郭剑明，张永康，王国民，等.膀胱癌患者测定尿纤维连接蛋白的临床意义[J].中华泌尿外科杂志，1998，19(3)：145147