感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞GRC-1的建立

　　作者：张成静，陈仁富，温儒民，王军起，陈家存，郑骏年，孙晓青 作者单位：徐州医学院附属医院泌尿外科,江苏徐州

　　【摘要】 目的 建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-sr39tk)基因的慢病毒感染的肾癌细胞株GRC-1。方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的基因的转移质粒共转染293T包装细胞，收集的病毒上清感染GRC-1细胞。结果 三质粒系统共转染293T细胞后获得较高滴度的慢病毒(2×109 U/L)。经RT-PCR检测证实HSV1-sr39tk基因已导入GRC-1细胞。结论 慢病毒载体可高效、稳定地感染GRC-1细胞，成功建立感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞株GRC-1。

　　【关键词】 突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶;肾癌细胞;慢病毒载体

　　Establishment of human renal cancer cell line GRC-1

　　transfected with lentiviral HSV1-sr39tk

　　ZHANG Chengjing, CHEN Renfu, WEN Rumin, WANG Junqi, CHEN Jiacun, ZHENG Junnian, SUN Xiaoqing

　　(Department of Urology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To establish the human renal cancer cell line GRC-1 transfected with lentiviral vector carrying the enhanced mutant herpes simplex virus thymidine kinase (HSV1-sr39tk). Methods Lentivirus was generated by three-plasmid transfection, i.e., the VSV-G envelope expression cassette, the △NRF packaging plasmid and the transfer plasmid containing target genes were co-transfected into 293T packaging cells by the enhanced calcium phosphate precipitation, and the collected lentivirus supernatant was applied to infect GRC-1cells. Results The three plasmids were co-transfected into 293T packaging cells and a high titer of lentivirus could be obtained (2×109 U/L). Transduction of HSV1-sr39tk gene into GRC-1 cells (GRC-1/39tk cells) was validated by RT-PCR detection. Conclusion Lentivirus carrier can infect GRC-1 cells efficiently and steadily, and thus human renal cancer cell line GRC-1 infected with lentivirus HSV1-sr39tk were successfully established.

　　Key words: HSV1-sr39tk gene; renal carcinoma cell; lentiviral vector

　　自杀基因疗法已经广泛应用于各种肿瘤的基础研究和临床实验性研究中。HSV1-tk/GCV系统是肿瘤自杀基因治疗中研究最为广泛且疗效得到肯定的前体药物系统。将该系统导入肿瘤细胞，从而诱导肿瘤细胞凋亡，可用于肿瘤治疗的研究。本研究建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-sr39tk)基因的慢病毒感染的肾癌细胞株GRC-1的方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料 HSV1-sr39tk由美国加利福尼亚大学Sanjiv S.Gambhir教授惠赠。含HSV1-sr39tk的慢病毒载体转移质粒pTK151/39tk由本室构建。人胚肾293T细胞、GRC-1细胞由本室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶、总RNA抽提试剂盒及RT-PCR一步法试剂盒均购自Promega公司。PCR引物由Invitrogen公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 慢病毒颗粒的包装 采用改良的磷酸钙沉淀法进行转染。将转移质粒(pTK151/39tk为实验组，pTK153为对照组;实验组含HSV1-sr39tk，对照组含绿色荧光蛋白)15 μg、包装质粒ΔNRF 10 μg、包膜蛋白质粒VSV-G 5 μg共转染293T包装细胞，转染12 h后，每日在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况，72 h后收集上清，0.45 μm滤器过滤后分装贮存于-80℃备用。

　　1.2.2 慢病毒感染GRC-1细胞及其鉴定 复苏的GRC-1细胞系于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中传代培养,培养液为含青霉素1×105 U/L、链霉素100 mg/L及体积分数为15%的小牛血清的RPMI 1640。达到实验所需细胞数量后将细胞稀释成0.5×108个/ L,分转24孔培养板培养24 h后备转染。分2组(实验组和对照组)按6×109/L将GRC-1细胞接种至50 ml培养瓶中。将上述包装好的病毒以感染复数(MOI)3∶1比例感染GRC-1细胞，培养3 h后加入2 ml RPMI 1640完全培养液继续培养，24 h重复感染，48 h后在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况。提取感染后的GRC-1细胞的总RNA行RT-PCR。所用PCR引物序列如下：上游引物P1为5′-ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT-3′，下游引物P2为5′-TCA GTT AGC CTC CCC CAT CT-3′。按RT-PCR一步法试剂盒方法建立如下反应体系：AMVI Tfi 5×反应缓冲液10 μl，dNTPs (每dNTP 10 mmol/L)1 μl，上游引物 3 μl，下游引物3 μl，25 mmol/L MgSO4 2 μl，AMV反转录酶(5 U/μl)1 μl，TfiDNA聚合酶(5 U/μl)1 μl，RNA样品5 μl，无核酶水24 μl，终体积50 μl。反应条件：48℃反转录45 min，94℃ AMV酶灭活及RNA/cDNA/引物变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火1 min，68℃延伸2 min，共35个循环，最后68℃延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 慢病毒的包装 三质粒系统共转染293T包装细胞后12 h即可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光表达，24～36 h荧光表达亮度最强。24 h后镜下见(70.0±4.2)%的对照组细胞表达绿色荧光(图1)。将慢病毒上清再感染293T细胞，测病毒滴度达2×109 U/L。

　　图1 对照组293T细胞转染结果(10×40)

　　2.2 慢病毒感染GRC-1细胞及HSV1-sr39tk基因在GRC-1细胞中的整合与鉴定 病毒感染GRC-1细胞后24 h，在倒置荧光显微镜下约(60.1±4.7)%的对照组细胞表达绿色荧光(图2)。提取GRC-1/39tk细胞总RNA后行RT-PCR，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，见1.16 kb处有一条阳性条带, 与PCR扩增产物的期望值吻合(图3),证实慢病毒成功感染GRC-1细胞且HSV1-sr39tk基因整合于GRC-1细胞基因组中。

　　3 讨 论

　　单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)由Moolten等于1986年首先报道，它是一种多功能酶，能广泛磷酸化嘌呤和嘧啶核苷类似物包括丙氧鸟苷(GCV)和无环鸟苷(ACV)等。表达HSV1-tk的肿瘤细胞能特异磷酸化GCV成单磷酸衍生物(GCV-MP)，并进一步被细胞内酶代谢为三磷酸衍生物(GCV-TP)，GCV-TP可掺入初生的DNA导致染色体断裂和姐妹染色体交换[1]，使细胞分裂停滞在S/G2期，主要通过凋亡机制致细胞死亡。本实验采用的是通过半随机序列诱变产生的HSV1-tk的突变型HSV1-sr39tk，对GCV/ACV具有更高敏感性[2]，其原因在于HSV1-tk酶活性位点或临近部位的数个氨基酸被替换，由此增强了对前体药物的转化能力[3]。

　　慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期表达，免疫反应小，安全性较好[4]，可以在更多的宿主细胞内生成高滴度的病毒。本研究中携带HSV1-sr39tk基因的慢病毒高效感染GRC-1细胞，成功建立感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞株GRC-1，为研究HSV1-sr39tk /ACV系统促肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡奠定了实验基础。

　　【参考文献】

　　[1] Thust R, Tomicic M, Klcking R, et al. Cytogenetic genotoxicity of anti-herpes purine nucleoside analogues in CHO cells expressing the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1: comparison of ganciclovir, penciclovir and acyclovir [J]. Mutagenesis,2000,15(2):177-184.

　　[2] Qasim W, Thrasher AJ, Buddle J, et al. T cell transduction and suicide with an enhanced mutant thymidine kinase [J]. Gene Ther,2002,9(12):824-827.

　　[3] Black ME, Kokoris MS, Sabo P. Herpes simplex virus-1 thymidine kinase mutants created by semi-random sequence mutagenesis improve prodrug-mediated tumor cell killing [J]. Cancer Res,2001,61(7):3022-3026.

　　[4] Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV, et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference [J]. Nat Genet，2003,33(3):401-406.