ND308抗脑缺血神经保护作用的研究

　　作者：谭君 梁绪国 严 鹏 田京伟 作者单位：1 青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院 烟台市 264000;2 烟台万华泌尿外科医院 3 山东省天然药物工程技术研究中心

　　【摘要】 目的 观察ND308对大鼠局灶性脑缺血的保护作用，探讨ND308抗脑缺血作用的机制。方法 78只健康雄性SD大鼠，采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion)模型，随机分为6组：模型组、假手术组、ND308小剂量组(5 mg/kg)、ND308中剂量组(10 mg/kg)、ND308大剂量组(20 mg/kg)，阳性对照依达拉奉组(6 mg/kg)，于再灌注后30 min内尾静脉注射给药。缺血2 h再灌注24 h后测定神经行为障碍评分、脑梗死体积，HE染色观察缺血皮层组织形态学变化，采用免疫组织化学染色法测定IL1β、TNFα、NFκB的表达。结果 ND308治疗组与模型组相比神经系统症状减轻，脑梗死体积缩小，下调脑组织中IL1β、TNFα、NFκB的表达，并呈现一定剂量依赖性，ND308小剂量组各项与模型组相比无统计学意义(P>0.05),其余各组与模型组相比P<0.05或P<0.01。结论 ND308对脑缺血再灌注具有保护作用作该作用可能有抑制炎症反应有关。

　　【关键词】 ND308;脑缺血再灌注;炎症反应;核因子κB

　　Neuroprotective effects of ND308 on focal cerebral ischemia in rats

　　TAN Jun1 LIANG Xuguo1 YAN Peng2 et al

　　1 Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University Medical College, Yantai 264000;2 Yantai Wanhua Urology Hospital

　　【Abstract】 Objective To investigate the neuroprotective effects of ND308 against focal cerebral ischemia in rats, and to discuss the possible mechanism.Methods A rat model of focal cerebral ischemiareperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion using modified filament method.A total of 78 healthy male SD rats with MCAO were randomly and equally divided into six groups: sham control group，model group，ND308 treated groups (5 mg，10 mg and 20 mg/kg )，positive control edalavone group (6 mg/kg). All drugs were administered via tail vein injection within 30 min after reperfusion. After 2 h ischemia followed 24 h reperfusion the neurological deficits and the sizes of cerebral infarction were measured. Immunohistochemistry was used to detect the expression of TNFα, IL1β and NFκB proteins.Results ND308 could decrease the neurological deficits and the sizes of cerebral infarction and also down regulate the expression of TNFα, IL1β and NFκB proteins in a dosedependent manner. ND308 lowdose group showed no statistical significance (P>0.05 vs model group). Other groups showed significant difference (P<0.05 or P<0.01 vs model group).Conclusion ND308 may have protective effects on focal cerebral ischemic reperfusion injury through antiinflammatory effect.

　　【Key words】 ND308，ischemiareperfusion，inflammatory reaction，NFκB

　　丹参为唇形科植物丹参(Saluia miltiorrhiza Bge) 的干燥根及根茎，其制剂丹参片、丹参注射液在临床上用于心脑血管疾病治疗。丹参酚酸B是丹参主要的活性成分，据报道丹参酚酸B能够减少脑缺血和/或脑缺血再灌注损伤，改善其行为障碍和学习记忆能力[1];而且丹参酚酸B能够改善微循环、促进血管新生[2]、调节基质金属蛋白酶(MMPs)活性，同时也能够抑制内皮细胞通透性[3]。化合物ND308【(2E)2{6[(E)2羧基乙烯基]2,3二羟基苯基}-3(3,4二羟基苯基)丙烯酸】为大鼠灌胃或者静脉注射丹参酚酸B之后在脑内发现的主要代谢产物，是一个从未报道过的全新化合物。山东省天然药物工程技术研究中心研究人员在体外将丹参酚酸B降解得到了该化合物，并于2007年8月申报了新化合物专利：“一种新的酚酸类化合物、制备方法及其药物组合物和应用”，专利申请号：200710015108.8。

　　通讯作者：梁绪国，Email:liangxuguo@yahoo.com.cn 化合物ND308为丹参酚酸B在脑内的降解产物，说明该化合物能够透过血脑屏障。我们前期研究发现ND308对缺糖缺氧致培养大鼠神经元损伤有显著的保护作用，现在我们利用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，观察ND308对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验动物 清洁级雄性Spragua Dawlay大鼠(合格证号：20030020)，体重250～300 g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供。

　　1.2 试验药物 ND308：由山东省天然药物工程技术研究中心提供，纯度99%以上，批号：061250。依达拉奉注射液: 江苏先声药业生产，规格10 mg/5 ml，批号80041101。

　　1.3 试剂 氯化三苯四氮唑(TTC)：Sigma公司，UltraSensitiveTMSP免疫组化染色试剂盒、多聚赖氨酸(PolyLLysine)、DAB显色试剂盒、柠檬酸盐组织抗原修复液：福州迈新生物技术开发有限公司;兔抗大鼠IL1β、TNFα、NFκB抗体：北京博奥森生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.4 方法

　　1.4.1 采用改良Longa法制作MCAO模型[4]，大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，颈部皮肤用碘伏消毒;颈部正中切开，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA),并沿ICA向下分离翼腭动脉(PPA)，结扎PPA、ECA及CCA近心端，于远心端备线，在CCA近分叉处剪一“V”形切口，将直径为0.24 mm的尼龙线光滑头端自切口处轻轻插入，经分叉处进入颈内动脉(CIA)，继续向前推进，遇有轻微阻力感，表明尼龙线头端已进入大脑中动脉并阻断血流，平均插入深度约为(1.8±0.5)cm, 固定尼龙线，记时。逐层缝合，尼龙线留约1 cm于皮外;缺血2 h后，将尼龙线轻轻抽出，使栓线头端在CCA内。此时依靠对侧脑血流通过大脑动脉交通支实现右侧脑组织血流再灌注，再灌24 h。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不导入栓线。待动物清醒后，观察神经系统症状以判断手术是否成功，将手术成功大鼠随机分为6组：模型组、假手术组、ND308小剂量组(5 mg/kg)、ND308中剂量组(10 mg/kg)、ND308大剂量组(20 mg/kg)，阳性对照依达拉奉组(6 mg/kg)。于再灌注30 min内经尾静脉注射给药，模型组与假手术组给予相同体积的生理盐水，持续缺血2 h再灌注24 h后处死动物。

　　1.4.2 于再灌注24 h末，由一位不了解分组情况的观察者按照Longa法[5]五分制评分标准对大鼠进行神经行为障碍评分，0分：无神经功能缺损症状;1分: 不能完全伸展对侧前肢;2分: 行走时向对侧旋转，出现“追尾”现象;3分: 站立不稳，向对侧倾倒;4分: 不能自发行走，意识障碍。

　　1.4.3 脑梗死体积测定采用TTC(氯化2,3,5-三苯基四氮唑)染色方法，大鼠处死后，迅速取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，在冰盘上连续冠状均匀切取5片，置入2%TTC染液中37℃恒温孵育20 min，用数码相机拍照，应用Champion ImageHPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测出各区脑梗死体积，根据公式：梗死体积 =[左侧半球体积-(右侧半球体积-苍白区体积)]/全脑体积，算出梗死体积百分比。

　　1.4.4 石蜡切片的制备：大鼠于再灌注后24 h以10%水合氯醛腹腔注射，大鼠过量麻醉后取仰卧位，固定四肢，快速剪开胸腹腔，暴露出心脏和主动脉弓，左心室插管至主动脉，先用生理盐水约200～300 ml灌洗，后用4%多聚甲醛约300 ml先快后慢灌注固定，直至动物呈僵硬状态，眼球变白，迅速断头取脑，用生理盐水洗干净后，置4%多聚甲醛中冷藏固定6～12 h，然后取出，均于视交叉后1 mm及4 mm处冠状切面切开鼠脑，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚4 μm)。

　　1.4.5 脑组织形态学检查：将制作好的石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察缺血侧大脑皮层的组织形态学变化。

　　1.4.6 测定脑组织中IL1β、TNFα、NFκB的表达：制作好的石蜡切片常规脱蜡、水化，严格按照试剂盒说明书进行操作，DAB显色，酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。空白对照采用PBS代替一抗，胞浆内着棕黄色或褐色颗粒者为蛋白表达阳性细胞。免疫组化的照片分析：每只大鼠取皮层脑组织切片，在20倍物镜下，采用ImageproPlus 5.0软件计数阳性细胞光密度值(IOD值)，反映切片上阳性细胞组化染色的强弱。

　　1.5 统计学处理 所有数据用x±s表示，采用方差分析和组间两两比较t检验，P<0.05认为有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 ND308对脑缺血再灌注大鼠神经行为障碍评分的影响 脑缺血再灌注模型组大鼠表现出明显的运动功能障碍，神经行为障碍评分增加，ND308小剂量组亦可改善缺血大鼠运动功能障碍，但与模型组相比无统计学意义(P>0.05);ND308大、中剂量组及阳性药依达拉奉可明显改善神经系统症状(P<0.05或P<0.01)，见表1。

　　2.2 ND308对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响 ND308大剂量组、中剂量组及依达拉奉组脑梗死体积明显低于缺血再灌注模型组(P<0.05或P<0.01)，见表1。表1 ND308对脑缺血/再灌注大鼠行为障碍评分和脑梗死体积的影响

　　2.3 ND308对脑缺血再灌注大鼠脑组织形态学的影响 假手术组大鼠缺血侧脑组织细胞排列整齐，细胞密度较大，胞浆丰富，HE染色着色较深，细胞核轮廓清晰，可见核仁、核膜，很少有坏死和凋亡细胞。模型组大鼠缺血侧脑组织变疏松细胞排列紊乱，细胞数明显减少，细胞间隙较大水肿引起的空泡化严重，胞浆着色较浅，可见大量凋亡和坏死细胞，表现为胞体皱缩，核固缩深染，核仁消失。ND308治疗组及阳性对照依达拉奉组大鼠脑组织细胞排列较整齐，间质水肿程度明显减轻，细胞数明显增多，皮层细胞变性、坏死减少，多数存活细胞形态相对正常，病变减轻，各项病理改变均有不同程度的改善,见图1。

　　2.4 ND308对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层组织炎症因子表达的影响 假手术组大鼠大脑皮层内没有或只有少量IL1β、TNFα、NFκB表达，NFκB主要集中在细胞浆内，缺血2 h再灌注24 h模型组大鼠大脑额顶叶皮质内IL1β、TNFα表达显著增加，NFκB表达增多且向细胞核内移动，与假手术组相比有显著性差异(P<0.001)，ND308小剂量组可减少缺血再灌注损伤后IL1β、TNFα表达，抑制NFκB向细胞核内转运，但与模型组相比P>0.05，ND308大、中剂量组及依达拉奉6 mg/kg组可明显减少上诉炎症因子表达(P<0.05或P<0.01)，见表2。表2 ND308对脑缺血再灌注大鼠大脑皮层组织

　　3 讨论

　　急性缺血性脑卒中的本质是脑血流障碍造成的脑损害，在治疗时间窗内早期恢复血流有利于缩小梗死范围、减轻神经损害。目前早期溶栓是治疗急性缺血性脑卒中最有效的措施，但由于溶栓时间窗的限制，事实上，所以能接受溶栓治疗的几率只有1%～2%[6]。同时，由于溶栓后再灌注引起的颅内出血、脑水肿等严重并发症也限制着溶栓治疗的推广应用。最近的研究表明，许多炎性介质和细胞因子介导的炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用[7]。

　　TNFα和IL1β是公认的炎性介质，可以促进脑缺血损伤区粘附分子的表达和炎性细胞的浸润[8]。Liu等[9]研究发现中脑中动脉阻塞后1 h即有TNFα mRNA的表达，3 h后缺血皮层中TNFα mRNA表达上升，12 h达高峰。阻塞5 d后缺血皮层中TNFα mRNA表达水平仍有明显的提高，在缺血皮层区的表达早在白细胞渗透之前出现，首次证明了在局部脑缺血造成的缺血性神经元中有TNFαmRNA及蛋白的表达。Minami等[10]用Northern blot法显示IL1βmRNA主要分布在海马回、下丘脑、皮质等。TNFα过度表达，可加重神经功能损伤，扩大脑梗死范围，导致缺血脑组织血流量的减少，进一步加重血脑屏障的损害，促进脑缺血和水肿的发生发展，最终导致细胞坏死或凋亡[11，12]。脑缺血再灌注后，细胞受到损伤，各种神经胶质细胞、血管内皮细胞、神经元和血管周围的炎性细胞被激活，分泌大量的IL1β，过多的、持续表达的IL1β可以诱导粘附分子的表达，导致大量中性粒细胞在血管上粘附，释放有害的炎性介质，引起脑组织的损伤;同时IL1β还可以激活内皮细胞产生多种活性物质，导致脑缺血程度加重[13，14]。

　　NFκB是近年发现的与缺血性脑损伤后脑组织中免疫应答反应密切相关的转录因子。许多研究表明，脑缺血时神经细胞、脑血管内皮细胞和胶质细胞中均有NFκB的活化[15]，多种因素如细胞因子、氧化剂、缺血等均是NFκB活化的刺激信号，NFκB活化后可促进粘附分子、立早基因、细胞表面受体和细胞因子的基因表达，进一步加重脑缺血过程的炎症反应。越来越多的证据显示，NFκB的激活是炎症反应的关键和焦点，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关。由于NFκB在缺血性脑损伤炎性反应中的中心作用，NFκB有望成为治疗缺血性脑血管病新的药理学靶点，为脑缺血的临床治疗提供了新的思路。

　　本实验显示ND308能够改善脑缺血再灌注大鼠神经行为学障碍，减小脑梗死体积，改善缺血组织形态学变化，能够减少缺血组织中IL1β、TNFα、NFκB的表达及抑制NFκB向细胞核内转运，对缺血脑组织损伤有明显保护作用，其机制可能与抑制炎症因子表达有关。

　　【参考文献】

　　[1] Tang M, Feng W, Zhang Y,et al. Salvianolic acid B improves motor function after cerebral ischemia in rats[J]. Behav Pharmacol,2006,17(56):493498

　　.[2] Han JY, Fan JY, Horie Y,et al.Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcirculatory disturbance and target organ injury by ischemia and reperfusion[J].Pharmacol Ther，2008，117(2):280295.

　　[3] Lin SJ, Lee IT, Chen YH.Salvianolic acid B attenuates MMP2 and MMP9 expression in vivo in apolipoproteinEdeficient mouse aorta and in vitro in LPStreated human aortic smooth muscle cells[J].J Cell Biochem，2007，100(2):372384.

　　[4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989，20(1): 8491.

　　[5] Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Stroke, 1986，8:1.

　　[6] Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke.The national institute of neurological disorders and stroke rtPA stroke study group[J].N Engl J Med，1995,333(24):15817.

　　[7] Tominaga T,Kure S,Narsiawa K,et al.Endonuclease action following focal ischemic injury in the rat brain[J].Brain Res, 1993,608: 2134.

　　[8] Yamasaki Y，Matsuura N，Shozuhara H，et al.Interleukin1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats[J].Stroke，1995，26(4)：676680.

　　[9] Liu T，Clark RK.Tumor necrosis factorα expression in ischemic neurons[J].Stroke，1994，25：14811488.

　　[10] Minami M，Kuraishi Y，Yabuuchi K，et al.Induction of interleukin1β mRNA in rat brain after transient focal brain ischemia[J].J Neurochem，1992，58(1)：390392.

　　[11]Barone F，Arvin B.Tumor necrosis factorα a mediator of focal ischemia brain injury[J].Stroke，1997，28(6)：12331244.

　　[12] Gong C，Qin Z，Betz AL，et al.Cellular localization of tumor necrosis factor alpha following focal cerebral ischemia in mice[J].Brain Res，1998，801(12)：18.

　　[13] Boutin H，LeFeuvre R，Horai R，et al.Role of IL1 alpha and IL1 beta in ischemic brain damage[J].J Neurosci，2001，21(15)：55285534.

　　[14] Legos JJ，Whitmore RG，Erhardt JA，et al.Quantitative changes in interleukin in proteins following focal stroke in the rat[J].Neurosci Lett，2000，282(3)：189192.

　　[15] Brand K,Page S,Rogler G,et al. Actirated transcription factor nuclear factorkappa B is present in the atherosclerotic lesion[J].J clinical Imestigation,1996,97(7):17151722.