姜黄素对马兜铃酸诱发的膀胱肿瘤的预防作用

    作者：李朝芝,邱惠,夏瑗瑜,谢丛华    作者单位：1. 武汉大学中南医院放化疗科;2.湖北省肿瘤生物学行为重点实验室；3.武汉大学附属同仁医院肾内科     【摘要】  目的 以马兜铃酸诱发的膀胱癌为模型，观察姜黄素对膀胱组织的病理变化、Ras蛋白和p53蛋白及细胞角质蛋白20（CK20）的变化，评价姜黄素对马兜铃酸诱导膀胱癌的化学预防作用及发生机制。方法 50只大鼠随机分为对照组、诱癌组、预防组三组。诱癌组：给予10mg（kg·d）马兜铃酸给大鼠灌胃,连续诱癌3个月；预防组：在诱癌的同时给予含2%姜黄素粉的饲料进行化学防护；对照组：为正常饮食和饮水。3个月后宰杀全部大鼠，取膀胱组织进行HE染色显微镜下观察病理变化，用免疫组化染色技术检测膀胱组织内Ras、p53蛋白的变化，荧光定量PCR技术检測CK20 mRNA。结果 经3个月诱癌，膀胱癌的发生率在诱癌组为95% (19／20)，而姜黄素预防组，膀胱癌的发生率仅为10%（2/20），对照组膀胱黏膜组织Ras、p53蛋白及CK20 mRNA均呈阴性表达，预防组及诱癌组膀胱黏膜组织Ras、p53蛋白及CK20 mRNA均呈阳性，且以诱癌组更明显，差异具有统计学意义（P<0.001）。结论 姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌具有良好的化学预防作用，可能分子机制与抑制 Ras、p53蛋白的过度表达能力有关。姜黄素有望成为一种有应用前景的膀胱癌预防药物。

    【关键词】  姜黄素;马兜铃酸;膀胱癌;预防作用

    Preventive Effects of Curcumin in Rat Bladder Tumor Induced by Aristolochic Acid

    LI Chaozhi1,2,3,QIU Hui1,2,XIA Yuanyu3,XIE Conghua1,2

    1.Department of ChemoRadiotherapy Oncology,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,China;2.Hubei Tumor Biological Behavoirs Key Laboratory,Wuhan University;3.Department of Nephrology,  Tongren Hospital,Wuhan University

    Corresponding Author:XIE Conghua，Email:chxie_65@ hotmail.comAbstract：Objective   Through observing the pathological change and the change of the Ras protein and p53 protein and cytokeratin 20(CK20) mRNA in bladder bladder tumor tissue induced by aristolochic acid，to evaluate the preventing effect of curcumin and explore the possible mechanism.Methods  Fifty rats were divided  into three groups randomly,control group,experiment group and  preventive  group.The rats in experimental group were given 10mg/(kg·d) of aristolochic acid for 3 months; do the same to the preventive group,and at the same time,added 2% curcumin powder to intervene; the rats in the control group received normal diet and water.After three months all of the rats were sacrificed  and  the bladder tissue obtained,the Ras protein,p53 protein and CK20 mRNA detected.Results  After three months,the incidence of the bladder tumor of the experiment group was 95% (19/20),while that of the preventive group was 10%（2/20）.The Ras protein and p53 protein and the CK20 mRNA in control group were negative,on the contrary,they were positive in the preventive group and the experiment group.The change of experiment group was obvious,showing statistical significance （P<0.001）.Conclusion  Curcumin had a preventive effect on the bladder tumor induced by aristolochic acid.The possible molecule mechanism was that curcumin can inhibit the over expression of Ras gene and p53 gene.

    Key words：Curcumin; Aristolochic acid;Bladder tumor;Preventing effect

    众多的细胞实验和动物试验证实姜黄素具有确切的抗癌活性，并具有抗癌谱广、毒副作用小的特点，是一种具有开发和应用前景的肿瘤预防和治疗新药[1，2]。

    马兜铃酸(aristolochic acid,AA)主要从马兜铃酸属植物细辛属植物中提取出来,具有镇痛、消炎、祛痰、利尿、调节血压、抗生育活性等作用以及可预防化、放疗引起的白细胞减少，因此在临床上得到了广泛的应用。然而,在使用过程中,发现含有马兜铃酸的药物常并发泌尿系肿瘤,使得马兜铃酸的致癌性成了一个新的研究热点[3]。本研究利用马兜铃酸诱导膀胱癌，应用2%姜黄素粉饲料对大鼠诱发的膀胱癌进行化学防护，观察姜黄素对马兜铃酸诱导膀胱癌的化学预防效果，为寻找马兜铃酸诱导膀胱癌的化学预防药物提供基础性资料。                        

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂  马兜铃酸购自SIGMA公司。姜黄素购自武汉中西仪器大全公司，批号HB108YHSY,姜黄素含量≥90%，在武汉大学医学院实验动物研究所加工成2%的姜黄素粉鼠饲料。Ras蛋白及p53蛋白试剂盒（SP9000/9001/9002 HistostainTMPlus Kits），购自武汉博士德生物工程有限公司。CK20荧光定量PCR 试剂盒购于上海朝瑞生物工程有限公司。CK20实时定量PCR使用引物由上海朝瑞生物工程有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

    1.2  动物模型  选用6周龄的清洁级Wistar大鼠50只，体重170～210g。分为对照组(10只)、诱癌组(20只)、姜黄素预防组(20只)。诱癌组给予10mg（kg·d）马兜铃酸给大鼠灌胃,连续灌胃诱癌3个月；预防组，同样给予10mg（kg·d）马兜铃酸给大鼠灌胃,连续灌胃诱癌3个月，诱癌同时给予含2%姜黄素粉的饲料进行化学防护。对照组为正常饮食和饮水。动物饲养在武汉大学附属第一医院SPF动物实验室。于３月末宰杀各组所有大鼠，统计大鼠膀胱癌发生率。

    1.3  组织取材  宰杀的大鼠迅速取膀胱组织。迅速把部分膀胱组织冻存于液氮罐中，储存备用。剩余的膀胱组织切成大小约为1cm×1cm×0.5cm, 4%多聚甲醛固定20～24h。HE染色显微镜下观察膀胱组织的病理变化。

    1.4  免疫组化染色  每例膀胱组织分别取6点，根据SP系列试剂盒说明进行Ras、p53蛋白免疫组化染色。阴性对照的一抗用PBS代替，阳性对照用己知阳性片进行染色。每张切片均观察整体染色情况，选择5个有代表性的区域， 每区计数200个细胞。统计每1000个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率。阳性细胞数≤10%为阴性，11%～30%为弱阳性，31%～50%为阳性，>50%为强阳性。Ras蛋白在胞浆，呈黄色；p53蛋白在胞核，呈棕褐色。

    1.5  荧光定量PCR  根据说明用TRIzol提取总RNA。用紫外分光光度计检测RNA纯度并定量，以此为模板，通过反转录反应以Oligo(dT) 15 作为引物，由total RNA的3’Poly(A) 区域引导出cDNA ，而后以cDNA产物为摸板，进行Realtime PCR反应。按照说明建立一个荧光定量PCR反应体系。按照一定的反应条件将以上反应体系放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900HT进行反应。仪器自动计算出标本中CK20和βactin的拷贝数/ml，以CK20和βactin比值作为CK20的表达水平。实验中所用的扩增CK20基因的上下游引物分别为5GGCAGCTGGGCAACAATG3，5 TCATGATCTCACCCAGGTTCAG 3，扩增βactin 的上下游引物分别为5 GCCCTTTCCTGTCCCATTG 3，5 CCAGTCCTGTGT TCGGCCT 3。

    1.6  统计学方法  根据资料性质Ras基因蛋白及P53基因蛋白进行χ2 检验法分析，CK20和内参基因（βactin）的比值以±s表示，采用t检验，均采用SPSS10.0软件进行统计学处理。

    2  结果

    2.1  不同处理组之间肿瘤形成的差异  如图1所示，经3个月诱癌，膀胱癌的发生率在诱癌组为95% (19／20)；而姜黄素预防组，膀胱癌的发生率仅为10.0%（2/20），不典型增生的发生率为20%（4/20），显示姜黄素具有良好的化学防护作用。

    2.2  姜黄素对p53、Ras基因蛋白的影响  10例对照组膀胱黏膜组织Ras、p53基因蛋白表达均呈阴性。20例预防组及20例诱癌组的大鼠膀胱黏膜组织Ras、p53基因蛋白均呈阳性，且以诱癌组更明显，具有明显统计学意义（P<0.001），见表1、2，图1d～i。

    2.3  不同组别CK20表达水平的比较

    结果分析使用 2  △△CT方法进行相对定量。对照组膀胱黏膜组织几乎无CK20表达，预防组及诱癌组膀胱黏膜组织CK20表达均增高，结果见图2。经t检验,预防组及诱癌组膀胱组织间CK20/βactin差异有统计学意义(P<0.001) ；对照组与预防组之间差异无统计学意义。

    3  讨论

    姜黄是一种多年生草本植物，其药用部分为根茎。姜黄素是其中的主要活性成分，生活中可作为调料和食物染色剂。同时姜黄素药理作用广，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂等作用，Rao等[4]报道2000ppm的姜黄素能明显抑制氧化偶氮甲烷(AOM)诱导的F344鼠的大肠癌。2%的姜黄根粉也可抑制化学诱癌剂诱发的皮肤癌和胃癌[5]。最近，孙明等[6]报道了姜黄素对膀胱癌EJ细胞的抑制作用。同时，姜黄素毒性很低，沃兴德等[7]进行了长期毒性试验，高剂量500mg(kg·d)，连续80天，动物各项检测指标未见异常。同时用人一次口服剂量的600倍对大鼠进行最大耐受量试验，动物未见任 表1  姜黄素对各组p53基因蛋白的影响:P<0.001何不良反应。Chuang等[8]报道了姜黄素的一期临床试验结果，8000mg/d,连续口服3个月，自愿者未发现不良反应。因而姜黄素是一种较理想的膀胱癌化学预防药物的候选者。

    本研究以马兜铃酸诱导膀胱癌，根据文献记载，动物实验应用姜黄素进行预防的饲料浓度为0.05%～2%，因其毒性低，我们选用含2%姜黄素粉的饲料进行预防，观察姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌的预防作用。HE染色病理结果显示在诱癌同时给予姜黄素干预，可明显减低马兜铃酸诱导的膀胱癌的发生率(95% vs.10.0%)。这显示姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌具有良好防护作用，能减少膀胱癌的发生率，延缓肿瘤的进展。

    Chuang等[8]用含0.2%纯姜黄素(99.3%)的饲料对二乙基亚硝胺诱导的C3H/HeN鼠肝癌进行预防实验，使肝癌的发病率和多发率明显降低。尽管动物、诱癌剂及诱发的肿瘤不尽相同，但我们用2%姜黄素粉饲料在Wistar大鼠获得马兜铃酸诱导的膀胱癌预防同样获得良好的效果。目前，国内外普遍认为[3]，AA通过形成AA DNA加合物，使原癌基因Ras基因发生A T颠换突变而活化，以及抑癌基因p53基因突变失去正常功能，引起促增殖信号的增强和细胞分化异常，导致肿瘤的发生。研究发现姜黄素诱导细胞凋亡的一个可能机制是下调抗凋亡蛋白( bcl2 、bclxl 、cmyc、野生型p53) 水平、上调凋亡蛋白( Fas) 水平[9]。本研究发现，姜黄素对Ras、p53基因蛋白有明显抑制作用，显示姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌的化学防护作用与Ras、p53基因调节的改变有关，基因调节的改变可在一定程度上反映姜黄素的化学预防作用，其可能分子机理与抑制Ras、p53基因蛋白的表达有关。又因其具有低毒、价廉等特点，我们认为姜黄素是一种有应用前景的马兜铃酸诱导的膀胱癌预防药物。

    CK20是细胞角蛋白的一种，主要分布在胃肠黏膜表层上皮细胞、尿路(肾孟、输尿管、膀耽)黏膜表层细胞、表皮的Merkel细胞，并特异地存在于这些上皮起源的肿瘤细胞中。作为一种新的膀胱肿瘤标记物，通过检测CK20的表达来研究移行细胞癌已成为目前的热点之一[10]。荧光定量PCR方法是一种新型的可作定量分析的PCR技术[11]。荧光定量PCR不同于以往的终点定量方法，是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。本实验应用实时荧光定量PCR方法检测膀胱癌组织及正常膀胱上皮中CK20mRNA 的表达情况,结果分析使用 2  △△CT方法进行相对定量,结果发现诱癌组CK20基因相对变化倍数明显高于预防组，而在10例正常对照组膀胱黏膜中均几乎无表达，通过以上结果证实姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌具有良好的化学预防作用。

    直接把肿瘤发病率降低作为临床化学预防试验的终点指标是不切实际的。随着对肿瘤发生、发展过程中的分子和表型改变的进一步了解，采用中间生物标记物(intermedical biomaker)来反映肿瘤的发生发展情况是评价化学预防效果的重要指标之一[12]。理想的中间生物标志物应满足以下条件:（1）与肿瘤的发生、发展密切相关，能反映肿瘤各个阶段特征性的变化;（2）容易检测，特别是在早期就能检测到它的变化:（3）其变化与预防剂的调控作用相关。一些指标如增殖、分化信号(如肌动蛋白、Vimentin)和基因/调节的改变 (如凋亡、癌基因或抑癌基因的表达)常被用做中间生物指标，评价药物的预防作用[13]。本文采用Ras、p53基因蛋白及CK20作为姜黄素临床化学预防试验的终点指标，评价姜黄素对马兜铃酸诱导的膀胱癌的化学预防作用，指导治疗，提供马兜铃酸诱导膀胱癌的化学预防药物的基础性资料。

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