基因靶向抑制反义生存素对人膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

    作者：范海涛    作者单位：130041 长春，吉林大学第二医院泌尿外科     【关键词】  生存素 寡核苷酸 反义 膀胱癌 凋亡

    生存素（survivin）基因在肿瘤特异性表达基因中，表达特异性列前4位[1]。其在膀胱癌诊断、治疗及判定预后等方面的研究日益深入[2]。我们应用survivin反义寡核苷酸和脂质体形成有效的复合物，观察其诱导膀胱癌细胞系T24凋亡的机制。报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  细胞系

    人膀胱癌株T24常规培养。

    1.2  寡核苷酸（ODNS）脂质体（Lip）转染复合物

    硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列如下：反义序列：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′；正义序列：5′CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG3′，均引自Gene Bank。脂质体lipofectamine2000，按转染试剂盒说明配置不同浓度的ODNsLip复合物。

    1.3  Western blot印迹试验

    转染48 h收集细胞，Triton试剂提取细胞总蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白含量。调整至蛋白浓度2 g/L，取10 μl样品加20 μl样品处理液，95 ℃水浴加热4 min，冷却至室温。于SDS聚丙烯酰胺凝胶中加样品15 μl，指示剂至电泳槽下缘边缘时取出胶版，以电转印仪将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以封闭蛋白干粉1 g加0.02 mol/L PBST 100 ml，37 ℃封闭1.5 h。用0.02 mol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜。DAB染色，照相。重复8次。

    1.4  MTT试验

    T24细胞起始浓度为1×104/孔。反义ODNsLip复合物100、200、400 nmol/L为转染组；正义ODNSLip复合物400 nmol/L和空白作为对照组。作用24h、48h及72h后经酶标分析仪于570 nm波长检测吸光度。

    1.5  流式细胞仪检测细胞凋亡变化

    取对数生长期的T24细胞，浓度为2×105个/ml。400 nmol/L 反义ODNsLip复合物进行转染，对照组应用RPMI1640培养液。流式细胞仪分别于24 h、48 h及72 h进行细胞凋亡检测。

    1.6  统计学方法

    采用Image Tool软件分析Western blot图像灰度值，应用单因素方差分析和q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Western blot印迹试验

    反义复合物处理T24细胞48 h，随着浓度增加，survivin蛋白表达水平下降，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。表1  Western blot印迹试验结果(±s)

    2.2  MTT法检测细胞抑制率

    反义复合物处理T24细胞后，随着浓度与作用时间的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

    2.3  流式细胞仪检测细胞凋亡

    T24细胞经作用后，流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。表3  400 nmol/L反义寡核苷酸作用不同时间后细胞凋亡率

    3  讨论

    survivin是一些恶性肿瘤有潜在价值的诊断标志和预后因子，其存在预示着肿瘤组织分化不良，临床分期高，5年生存率及总生存率下降，无瘤生存时间缩短，复发率增加[3，4]。survivin是肿瘤特异性的凋亡抑制蛋白，在成人大多数肿瘤组织中表达水平异常升高[5]。可采取抑制其表达或干扰其作用的策略来治疗肿瘤，其分子靶向治疗单独或与其他抗癌治疗联合应用，可抑制体外肿瘤的形成及已形成肿瘤的生长[6]。

    本研究中Western blot印迹试验表明survivin反义复合物可以下调T24细胞survivin蛋白表达，其表达水平随着反义复合物浓度的增加而进行性下降。提示脂质体的反义转染是成功的，反义survivin复合物可以明显下调T24细胞survivin蛋白的表达，并呈现一定的浓度依赖性。MTT结果显示T24细胞凋亡率随处理时间的延长而呈现增加趋势。流式细胞仪检测出T24细胞经反义surivin复合物处理后出现典型的细胞凋亡亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加。亚二倍体峰的出现与增加是量化膀胱癌细胞凋亡的客观指标，说明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，且凋亡细胞率有一定时间依赖性。

    研究表明，survivin分子靶向治疗可通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管形成的双重机制来发挥抗肿瘤作用[7]。高凋亡指数组患者的5年生存率明显高于低凋亡指数组，说明诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的抗肿瘤治疗手段[8]。本组资料表明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导体外培养人T24膀胱癌细胞发生凋亡，可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。  

【参考文献】[1]  Rodel F,Hoffmann J,Distel L,et al.Survivin as a radioresistance factor, and prognostic and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer[J].Cancer Res,2005,65(11):48814887.

[2] Weikert S,Christoph F,Schrader M,et al.Quantitative analysis of survivin mRNA expression in urine and tumor tissue of bladder cancer patients and its potential relevance for disease detection and prognosis[J].Int J Cancer,2005,116(1):100104.

[3] Cohen C,Lohmann CM,Cotsonis G,et al.Survivin expression in ovarian carcinoma:correlation with apoptotic markers and prognosis[J].Mod Pathol,2003,16(6):574583.

[4] Dong Y,Sui L,Watanabe Y,et al.Survivin expression in laryngeal squamous cell carcinoma and prognostic implications[J].Anticancer Res,2002,22(4):23772384.

[5] Kato J,Kuwabara Y,Mitanni M,et al.Expression of Survivin in esophageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J].Int J Cancer,2001,95(2):9295.

[6] Altieri DC.Validating survivin as a cancer therapeutic target[J].Nat Rev Cancer,2003,3(1):4654.

[7] BlancBrude OP,Mesri M,Wall NR,et al.Therapeutic targeting of the survivin pathway in cancer:Initiation of mitochondrial apoptosis and suppression of tumorassociated angiogenesis[J].Clin Cancer Res,2003,9(7):26832692.

[8] Momekov G,Bakalova A,Konstantinov S,et al.Comparative assessment of the cytotoxic effects of carboxylatobridged dinuclear platinum (II) complexes against human tumor cell lines[J].Neoplasma, 2005,52(6):469475.