金属硫蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

作者：霍韶军1，张瑞刚1，董海燕1，田云霄2，张建华1，高社全1，张振江1 　　【关键词】  膀胱癌；金属硫蛋白；免疫组织化学

　　Expression of metallothionein in bladder transitional cell cacinoma and its clinical significance

　　Huo Shaojun1, Zhang Ruigang1, Dong Haiyan1, Tian Yunxiao2, Zhang Jianhua1, Gao Shequan1, Zhang Zhenjiang1

　　(1. Department of Urology; 2. Department of Pathology, the Center Hospital of Handan City, Handan 056001, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the clinical significance of metallothionein in bladder transitional cell cacinoma (BTCC). Methods  72 specimens of BTCC were assessed by immunohistochemical method (SP method). Results  Among the 72 cases, the positive rate of metallothionein in Grade Ⅰ, Grade Ⅱ and Grade Ⅲ of BTCC was 34.8%, 55.6% and 92.8%, and was 64% in initial BTCC and 87.3% in recurred BTCC. Conclusion  Metallothionein may be a valuable marker of drug resistance, invasive behavior and recurrence in BTCC.

　　KEY WORDS: bladder transitional cell carcinoma; metallothionein; immunohistochemically

　　摘要：目的  探讨金属硫蛋白表达在膀胱移行细胞癌治疗及预后方面的临床价值。方法  采用免疫组织化学SP法对72例膀胱移行细胞癌标本进行金属硫蛋白染色，并结合临床进行分析。结果  金属硫蛋白在膀胱移行细胞癌G1、G2与G3级的表达分别为34.8%、55.6%、92.8%。在初发及复发膀胱癌中的阳性表达率分别为64%、87.3%，统计分析金属硫蛋白在膀胱移行细胞癌不同的病理分级间以及复发与初发间的表达分别存在显著性差异。结论  金属硫蛋白可作为膀胱癌复发、耐药及高度恶性的一个潜在指标。

　　关键词：膀胱癌；金属硫蛋白；免疫组织化学

　　膀胱肿瘤在我国是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。恶性肿瘤易复发、转移，对化疗药物易产生耐药性是治疗的难点，同样也是膀胱肿瘤的治疗难点。金属硫蛋白(Metallothionein, MT)与肿瘤的发生、生物学行为和预后密切相关。因此，我们应用免疫组织化学方法对金属硫蛋白在不同病理分级的膀胱移行细胞癌细胞中的表达情况进行了研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  一般资料  收集邯郸市中心医院病理科2002年9月至2004年3月间资料完整的膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell cacinoma, BTCC)手术存档的石蜡块标本72例。其中男性55例，女性17例。男女比例3.4∶1，年龄21-81岁，平均58.7岁。经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of bladder cancer, TURBT)50例，膀胱部分切除术14例，膀胱全切除术8例。其中初发膀胱移行细胞癌39例，复发膀胱移行细胞癌33例。根据世界卫生组织(WHO)分类标准进行病理分级，其中G1 27例，G2 31例，G3 14例。所有石蜡块标本均作厚3μm连续组织切片备用，用外伤患者的膀胱黏膜作为正常对照组。

　　1.2  免疫组织化学方法  免疫组化采用链霉菌过氧化物酶法(SP法)，一抗鼠抗人金属硫蛋白单克隆抗体，克隆系E9，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。切片常规脱蜡至水，3%(体积分数)双氧水消除内源性过氧化物酶的活性，柠檬酸组织抗原修复液修复抗原，依次加入一抗、二抗、三抗及DAB显色剂，苏木素复染，中性树胶封片，正常对照组应用PBS液代替一抗，其余步骤相同。

　　1.3  结果判定  细胞浆内或胞核内出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，对所有标本进行半定量评估。首先将切片置于低倍镜下(×40)观察，确认标记最强的区域。每张切片选择4个标记最强的区域在高倍镜下(×400)计数MT阳性细胞百分数(MT阳性细胞数/计数细胞数×100%)，计算出平均数，分为无标记(-)、标记少于25%(+)、介于25%-50%()、大于50%()四个等级。采用Panasonic WVCP4601CH图象采集系统进行显微照相。

　　1.4  统计学处理  采用SAS8.0统计软件包进行统计分析。MT的表达与膀胱移行细胞癌病理分级的关系及MT的表达与膀胱移行细胞初发癌、复发癌的关系均采用χ2检验。

　　2  结    果

　　MT阳性细胞染色表现为细胞浆内(有的包括细胞核)出现棕黄色颗粒，散在分布于肿瘤细胞内，接近于基底层的肿瘤细胞表达强度高于表层肿瘤细胞。同样在侵袭性膀胱癌细胞中也发现类似的情况，越接近于深层的肿瘤细胞其表达强度越高于表层肿瘤细胞(见图1、图2)。

　　图1－图2  略

　　72例膀胱移行细胞癌中， G131例中MT过表达(、)者8例(34.8%)；G2 27例中MT过表达者15例(55.6%)；G3 14例中MT过表达者12例(85.7%)。三者间MT过表达率存在显著性差异(P<0.05，表1)。MT表达者，G1 4例(12.9%)，G2 5例(18%)，G3 8例(61.5%)，经统计学分析G1、 G2间无统计学意义，G1、 G2与G3间有统计学意义(P<0.05)。其中初发肿瘤MT阳性表达与复发肿瘤MT阳性表达间存在统计学意义(P<0.05，表2)。

　　表1  MT在不同病理分级膀胱移行细胞癌中的表达情况　略

　　3  讨    论

　　膀胱移行细胞癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。恶性肿瘤的易侵袭、转移、复发是肿瘤治疗的难点，因此早期对肿瘤的特性作一评估，对肿瘤的治疗及预后将产生巨大的帮助。目前为止，临床上仍多采用以形态学上的病理分级及临床分期作为推测肿瘤恶性趋势的指标。但由于肿瘤的异质性、生物学行为的多样性，不能够全面评估肿瘤的特性。因此，寻找一个或多个具有特异性的指标，来预测肿瘤的某些特性，如侵袭、转移的能力及耐药发生的几率成为目前研究的热点。肿瘤标记物可以是血液、体液或组织中存在的某些蛋白质等。膀胱癌肿瘤组织中MT含量与正常组织中明显不同，可能是膀胱癌的一种潜在标记蛋白。自1957年Margoshe和Valle[1]从蓄积镉的马肾中分离出MT来以后，人们对MT的基因的组成、结构及其功能，以及金属结合位点进行了深入的研究。研究发现MT是一类广泛存在于哺乳动物组织中的非酶类蛋白质，在机体胚胎发育或组织再生过程中能程序性诱导合成。MT是一类低相对分子质量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其主要功能是调节机体内微量元素代谢，对有毒金属进行解毒，清除自由基，保护细胞免受放射线及烷化剂的损伤。MT存在于哺乳动物以外除结缔组织中。MT的基因片段位于人类16号染色体上，其基因的5′启动区至少存在两个调控片段，即金属反应元件和糖皮质激素反应元件。Haras癌基因在控制MT的合成中发挥着重要作用，在某些肿瘤组织中Haras癌基因处于激活状态，从而作用于MT基因启动区的调控片段，使得MT基因被激活，导致MT的表达增加。在许多肿瘤组织中都可检测到MT的表达，如乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、精原细胞瘤、膀胱癌等多种肿瘤细胞中均有MT的表达。Saga[2]等研究了91例膀胱移行细胞癌标本，发现高病理分级肿瘤中有MT的过表达，认为MT的表达与肿瘤的病理分级密切相关。正常膀胱黏膜细胞中MT为阴性表达(基础表达)，随着肿瘤的病理级别由G1上升到G3，MT的阳性表达率也相应地由4.3%、35.7%增加到65.4%。同时发现膀胱非乳头状瘤的MT表达率高于膀胱乳头状肿瘤。Saika[3]等研究显示肾肿瘤及膀胱肿瘤细胞中均有MT的过表达，且认为肾肿瘤细胞中MT的表达高于膀胱肿瘤细胞。MT的过度表达不仅与肿瘤的病理级别密切相关，同时也与预后密切相关。复发肿瘤中的MT阳性率明显高于初发肿瘤。Gouldling[4]等认为MT表达率低者，复发率较低，存活时间较长，预后较好。而MT含量高者则复发率高，存活时间短，预后较差。我们的研究也得出类似的结论。许多研究学者认为MT的过度表达与肿瘤对化疗药的耐药性成正相关。Saika[3]分析了35例对化疗药产生耐药的膀胱癌标本，其中10例存在MT过度表达。Kelley[5]等认为MT过度表达主要导致肿瘤细胞对亲电性化疗药物的耐药，如对卡铂、顺铂、苯丁酸氮芥、左旋苯丁氨酸氮芥等。而对非亲电性化疗药如氟尿嘧啶、长春新碱等，则没有影响。Kondo[6]等将含有人MT的基因片段转导到小鼠的C127细胞内，发现小鼠C127细胞内的MT含量可增加10倍，对卡铂等亲电性化疗药的耐药性也相应增加4.4倍，而对氟尿嘧啶和长春新碱等非亲电性化疗药的敏感性则没有改变。我们的研究也显示经过治疗复发的肿瘤，MT的表达率高于初发的肿瘤。两者比较有统计学意义。显示MT肿瘤的复发和耐药性有关。金属硫蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达，随着肿瘤病理分级的增高而增高，过度表达可能与肿瘤细胞内环境紊乱有关。MT过度表达预示着肿瘤对化疗药的耐药，尤其对亲电性化疗药的耐药，因此MT可能是肿瘤易浸润、易复发及易对化疗药耐药的一个标记物。

　　参考文献：

　　[1]Kagi JHR. Metallothionein proceedings of the first international meeting on metallothionein and other Low molecular weight metalbinding proteins [J]. Experientia Suppl, 1979:343378.

　　[2]Saga Y, Hashimoto H, Yachiku S, et al. Immunohistochemical expression of metallothionein in human bladder cancer: correlation with histopathological parameters and patient survival [J]. J Urol, 2002, 168(5):22272231.

　　[3]Saika T, Tsushima T, Nasu Y, et al. Histopathological study of metallothionein in bladder cancer and renal cell carcinoma [J]. Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi, 1992, 83(5):636642.

　　[4]Goulding H, Jasani B, Pereira H,et al. Metallothionein expression in human breast cancer [J]. Br J Cancer, 1995, 72(4):968972

　　[5]Kelley SL, Basu A, Teicher BA, et al. Overexpression of metallothionein confers resistance to anticancer drugs [J]. Science,1988, 241(4874):18131815.

　　[6]Kondo Y, Woo ES, Michalska AE, et al. Metallothionein null cells have increased sensitivity to anticancer drugs [J]. Cancer Res,1995 ,55(10):20212023.