猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中的表达及意义

作者：曹军，李建平，程伟，陈琦    作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004

 【摘要】  　　目的 检测猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中的表达，探讨支原体感染与肾癌发生的关系。方法 选取本院肾癌石蜡包埋标本95例，以远离肾癌的正常肾组织标本60例为对照，采用免疫组织化学方法检测肾组织中猪鼻支原体P40蛋白的表达情况。结果 肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白阳性表达率为64.2%(61/95)；癌旁正常肾组织的阳性表达率为21.7%(13/60)，两者相比差异具有显著统计学意义(P<0.001)。结论 肾癌的发生与支原体感染有一定的相关性，支原体感染可能是肾癌的生物学致病因素。

【关键词】  支原体 感染 肾癌

　　Expression of mycoplasma hyorhinis P40 in the tissues of renal cell carcinoma

　　Cao Jun, Li Jianping, Cheng Wei, Chen Qi

　　(Department of Urology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the association between mycoplasma infection and pathogenesis of renal cell carcinoma (RCC). Methods  There were 95 samples of archived embedded tissues of RCC and 60 samples of archived embedded normal renal tissues around the tumor for comparison. We detected mycoplasma hyorhinis P40 expression in archived embedded renal tissues by immunohistochemistry (IHC) with mycoplasma hyorhinis monoclonal antibody (MAb) PD4. Results  Mycoplasma hyorhinis P40 was present in 64.2% (61/95 cases) of RCC and in 21.7% (13/60 cases) of the paratumor normal renal tissues in controls. The mycoplasma hyorhinis P40 expression ratio in RCC was significantly higher than that in the normal renal tissue, around the tumor (P<0.001). Conclusion  There was a correlation between mycoplasma infection and pathogenesis of RCC. Mycoplasma infection could be a biological factor in the oncogenesis of RCC.

　　KEY WORDS: mycoplasma; infection; renal cell carcinoma

　　支原体是广泛存在于自然界的条件致病微生物，可能是唯一可以与真核生物共生，并可与哺乳动物细胞长期相互作用的原核生物。某些支原体慢性持续性感染可导致细胞多阶段恶性转化和上调癌基因的表达，并引起细胞生物学行为的改变，提示支原体感染可能与肿瘤的发生有潜在的相关性［1-6］。目前对于支原体感染与胃肠道肿瘤、卵巢肿瘤的关系已有较多报道，但与肾癌关系的研究报道甚少。在本研究中我们应用免疫组织化学技术对肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白的表达进行了检测，旨在探讨支原体感染与肾癌发生的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料

　　选取本院1990年至2005年间肾癌石蜡包埋标本95例，其中男性69例，女性26例，年龄24-79岁，平均62.5岁。按肿瘤细胞类型分为透明细胞癌60例、乳头状肾细胞癌15例、嫌色细胞癌20例。肿瘤细胞的分化程度按Fuhrmans病理分级［7］，包括Ⅰ级51例、Ⅱ级31例、Ⅲ级13例；按TNM分期标准，分为Ⅰ期21例、Ⅱ期32例、Ⅲ期33例、Ⅳ期9例。另取60例远离肾癌的正常肾组织作为对照组。

　　1.2  主要试剂

　　鼠抗猪鼻支原体单克隆抗体PD4，由北京大学临床肿瘤学院肿瘤防治所寿成超教授惠赠；生物素标记二抗、即用型免疫组织化学SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

　　1.3  方法

　　1.3.1  猪鼻支原体P40蛋白的检测

　采用免疫组织化学SP法：①石蜡标本4 μm连续切片，脱蜡和水化；②3%(体积分数)过氧化氢溶液室温浸泡10 min；③10%(体积分数)血清室温封闭20 min；④滴加鼠抗猪鼻支原体单克隆抗体PD4(10 mg/L)，37 ℃下孵育90 min；⑤滴加生物素标记二抗，37 ℃下孵育30 min；⑥加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育20 min；⑦DAB显色，苏木素复染及中性树胶封片。

　　1.3.2  对照设计

　　用已知PD4染色阳性的胃癌标本作为阳性对照，用正常小鼠IgG为阴性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。

　　1.4  结果判断

　　阳性结果为棕黄色染色。阳性染色强度分析，连续观察10个高倍视野(×400)，每视野数100个细胞，计算每视野平均阳性细胞数。镜下按胞质和胞膜有无棕黄色显色和阳性细胞的多少而分为3个等级：阴性(-)：无阳性细胞；阳性(+)：阳性细胞占50%以下且显色浅；阳性()：阳性细胞占50%以上且显色很深。

　　1.5  统计学处理

　　应用SPSS11.0软件包对实验数据进行χ2检验、Fishers确切概率法及相关性分析。检验水准为：α=0.05。

　　2  结果

　　2.1  猪鼻支原体P40蛋白的肾组织中的分布和表达肾癌组织标本中猪鼻支原体P40蛋白表达的阳性信号主要定位于癌细胞的胞质和胞膜，呈棕褐色，片状分布(图1A、1B)，癌周正常肾组织标本中猪鼻支原体P40蛋白表达的阳性信号主要在肾小管细胞中分布(图1C)。95例肾癌组织标本中有61例显示阳性表达，阳性表达率为64.2%；60例远离肾癌的正常肾组织中47例猪鼻支原体P40蛋白呈阴性表达，仅有13例呈阳性表达，阳性表达率为21.7%，两者相比差异具有统计学意义(P<0.001，表1)。

　　2.2  猪鼻支原体P40蛋白在不同病理类型肾癌组织中的表达

　　肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌和嫌色细胞癌组织中的猪鼻支原体P40蛋白阳性表达率分别为65.0%(39/60)、53.3%(8/15)和70.0%(14/20)，三者间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1  猪鼻支原体P40蛋白表达与肾癌临床病理特征的关系（略）

　　3  讨 论

　　早在20世纪60年代，已有人从白血病患者骨髓中分离到支原体，将支原体接种到小鼠体内可诱发类白血病样症状。近年来，尤其是在艾滋病患者体内的Kaposi肉瘤中发现支原体后，支原体与肿瘤的关系越发受到重视。猪鼻支原体是从猪体内首先被分离出来的支原体，是正常猪鼻腔内的寄生菌，在一定条件下可引起小猪多发性浆膜炎和关节炎等疾病。目前研究表明猪鼻支原体与人类某些肿瘤形成有密切关系［1-6］。

　　马华崇等［8］为了获得肿瘤组织中存在支原体感染的最直接证据，在尽可能的无菌条件下对收集的20例新鲜胃癌组织手术标本，利用PPLO培养基从胃癌组织中分离培养猪鼻支原体，并用聚合酶链反应(PCR)检测阳性培养产物中猪鼻支原体的特异性基因序列片段。结果除1例标本细菌污染外，19例胃癌组织中有4例获得阳性培养产物，阳性率为21.1%。该4例阳性培养物中均扩增出猪鼻支原体的特异性序列片段。

　　刘斌波等［9］通过培养猪鼻支原体提取其抗原，免疫家兔后获得其特异性抗血清，然后使用链霉亲和素-生物素过氧化物酶(SABC)方法，检测32例人结肠腺癌和5例不同组织胚胎细胞标本，结果显示猪鼻支原体相关抗原在29例癌细胞胞膜及胞浆中有表达，在癌周正常组织细胞和胚胎细胞无表达，阳性率90.6%。

　　Ilantzis 从肺癌和结肠癌细胞系培养基中纯化分离出猪鼻支原体膜蛋白P40，分子质量为40 ku。P40能够提高体外培养细胞的侵袭性，猪鼻支原体提高肿瘤细胞集落形成的能力也与P40分子有关。P40通过与细胞的某种膜蛋白结合导致细胞增殖相关的信号通路活化，使支原体感染后的肿瘤细胞具有更高的集落形成能力；而单克隆抗体PD4则可能阻断P40与细胞膜蛋白的结合，进而阻断支原体促进细胞增殖的作用。另外，PD4也能通过对猪鼻支原体的生长抑制而发挥作用［3］。

　单克隆抗体PD4是北京市肿瘤防治研究所用胃癌细胞系MGC803细胞免疫正常同系裸鼠(BALB/C)，经细胞筛选而获得的。该抗体能引起MGC803细胞的凋亡，抑制Ras转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力，并降低其在裸鼠中的致瘤能力。Huang等［10］从分子水平克隆了单克隆抗体PD4的对应抗原P40，通过测序、Hoechst22358荧光染色及支原体DNA扩增等方法被证明为猪鼻支原体，从而表明单克隆抗体PD4为抗猪鼻支原体抗体。

　　本实验通过单克隆抗体PD4免疫组织化学方法对95例肾癌组织和60例癌旁正常肾组织中的猪鼻支原体P40蛋白的表达进行了测定。结果显示，肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白阳性表达率为64.2%，癌旁正常肾组织阳性表达率为21.7%，两者差异具有统计学意义。这与Huang等［10］在食道癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤组织中检测到的猪鼻支原体P40蛋白阳性表达率相接近。提示猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中存在着稳定的表达，其感染与人类肾癌的发生存在某种相关性，可能是肾癌的生物学致病因素。

　　Liu等［6］证明猪鼻支原体和人类恶性细胞之间存在相似的抗原表位。本实验检测出人类肾癌组织中癌细胞的胞质和胞膜中有猪鼻支原体P40抗原表达，表明猪鼻支原体与人类肾癌组织间存在共同抗原。将猪鼻支原体P40蛋白作为一种新的肿瘤标志物，用于肾癌的检测以及在研究猪鼻支原体与人类恶性肿瘤的关系方面具有一定的理论和实际意义。    　　为了进一步了解肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白的表达与肾癌组织病理特征的关系，本实验比较了猪鼻支原体P40蛋白在不同病理类型的肾癌组织中的表达。结果显示不同病理类型肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白的表达并没有显著差异，表明支原体感染与人类肾癌的病理类型不存在某种相关性。

　　从目前对穿透支原体和发酵支原体导致细胞恶性转化的研究中发现，支原体导致细胞转化是一个具有长潜伏期的慢性过程。支原体不同于病毒，不是将自身基因导入宿主细胞基因，而是通过与相应的配体结合寄居于细胞表面，通过影响细胞从胞膜到胞核的信号传递，导致H-ras和C-myc等基因过度表达，最终影响到宿主细胞的多种重要生物学特性。支原体能够引起长期无症状的感染，抑制细胞凋亡，引起细胞转化。目前较为普遍接受的理论认为［11-12］，慢性持续性支原体感染对哺乳类细胞可能产生两方面的影响：①通过与膜受体作用，活化一个抗凋亡的放大信号，抑制细胞凋亡；②通过诱导多种细胞因子的产生，以及持续存在的活的有机物，扰乱细胞的正常信号传递通路，从而改变细胞的功能及基因的表达，最终导致细胞转化。尽管本研究结果提示支原体在肾癌组织中有一定的感染率，但由于支原体的分型极为复杂，要真正阐明支原体感染与肿瘤发生的关系，尤其是具体到支原体感染与肾癌发生的分子生物学机制，尚有大量的工作要做。

【参考文献】  　　［1］宁金鹰，寿成超. 支原体感染与肿瘤 ［J］. 癌症, 2004, 23(5):602-604.

　　［2］Kwon HJ, Kang JO, Cho SH, et al. Presence of human mycoplasma DNA in gastric tissue samples from Korean chronic gastritis patients ［J］. Cancer Sci, 2004, 95(4):311-315.

　　［3］李秀云，张帝开. 支原体感染与肿瘤发生的研究进展 ［J］. 中国实用妇科与产科杂志, 2005, 21(11):691-693.

　　［4］Chen XC, Chang LJ. Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells ［J］. J Biomed Sci, 2005, 12(1):31-46.

　　［5］Zhang SM, Tsai S, Lo SC. Alteration of gene expression profiles during mycoplasma-induced malignant cell transformation ［J］. BMC Cancer, 2006, 5(6):116.

　　［6］Liu WB, Zhang JZ, Jiang BH, et al. Lipoprotein p37 from mycoplasma hyorhinis inhibiting mammalian cell adhesion ［J］. J Biomed Sci, 2006, 13(3［7］吴永安. 肾细胞癌分类、分级、分期现状和预后因素 ［J］. 医师进修杂志, 2005, 28(2):1-4.

　　［8］马华崇，马泓，张艳丽，等. 胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定 ［J］. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(2):31-33.

　　［9］刘斌波，刘先州，刘东瀛，等. 猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究 ［J］. 武汉大学学报(医学版), 2001, 22(1):6-7.

　　［10］Huang S, Li JY, Wu J, et al. Mycoplasma infections and different human carcinomas ［J］. World J Gastroenterol, 2001, 7(2):266-269.

　　［11］Mustafa P, Sacide P, Huseyin O, et al. Can mycoplasma-mediated oncogenesis be responsible for formation of conventional renal cell carcinoma? ［J］. Urology, 2005:411-414.

　　［12］Gerlic M, Horowitz J, Farkash S, et al. The inhibitory effect of mycoplasma fermentans on tumour necrosis factor (TNF)-alpha-induced apoptosis resides in the membrane lipoproteins ［J］. Cell Microbiol, 2007, 9(1):142-153.