组织工程技术在泌尿外科的应用进展

作者：张秉鸿综述，符伟军，王晓雄审校    作者单位：解放军总医院泌尿外科，北京 100853 　　【关键词】  组织工程

　　泌尿系器官由于先天性异常或后天性损害(如创伤、肿瘤、炎症、烧伤等)造成缺失，需要进行重建或修复。以往利用自身某些组织作为替代材料(如膀胱肿瘤行全切后以小肠替代等)，存在取材操作复杂、材料来源局限、并发症多等问题；而且这种修复很少能完全替代原组织器官的结构和功能。利用结构和功能近似的修复材料进行修复重建，可最大程度上恢复受损器官的结构和功能。

　　1  组织工程基本原理

　　1.1  概念  作为现代修复医学的重要组成部分，组织工程是依循细胞培养、材料学、工程学的原理培育、塑造能使组织器官功能恢复并维持的生物材料。细胞用于组织工程时，小片供体组织被粉碎后游离出单个所需细胞。这些细胞被直接种植于宿主体内或贴附于基质，经培养、扩增后再种植于宿主体。供体可为异种、同种异体、自体的同源或异源组织；最理想的是自体细胞，即从宿主体以针刺法取得的细胞经游离、培养、扩增后移植回原宿主[1]，避免了排异反应，也减少了因使用免疫抑制剂引起的副作用。在体外获取大量附有特定细胞的替代材料比较困难。尿路上皮细胞能够在体外培养，但要大量扩增就比较困难。近年已能鉴别非分化细胞，并能使其在生长期保持不分化。利用这些培养技术，可使尿道上皮细胞由起初面积1cm2在8周内扩展到4202m2(一个足球场面积)。这就保证有足够量的细胞移植回自体进行组织修复。近10年一系列原始祖细胞培养获得成功，使得利用自身细胞重建组织进入临床应用成为可能。

　　1.2  组织工程材料  组织工程材料按其应用分为：①应用去细胞基质(acellular matrices)，即单纯利用基质，依靠机体自然定向新生的组织对受损组织进行修复。通常是以化学或物理方法除去细胞成分而获得富含胶原的基质。②应用附有细胞的基质。两种基质均于种植处缓慢降解并最终完全被处于再生状态的细胞分泌的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)逐渐替代。修复材料为取自自体组织的去细胞基质，代替上述人工合成的材料来修复组织。生物材料为细胞塑育出具有恰当结构和理想功能的新生组织提供了合适的立体空间，也利于细胞的递送和生物活性因子(如细胞黏附肽、细胞因子等)的释放。因为大多数哺乳动物的细胞是“铆钉依赖性的”，没有合适的细胞黏附场所将会死亡。生物材料提供的细胞黏附场所可使细胞高效率地到达特定的部位。生物材料还可提供机械性支持以对抗体内的组织压力，保证植入的组织在新生修复过程中保持其立体结构不变形。生物活性因子(如细胞黏附肽、生长因子等)伴细胞同时释出，帮助调节细胞的生长。 理想的生物材料应具有：①良好的生物相容性；②理想的降解性；③提供能使细胞调节发生(如黏附、扩增、迁移和分化)、进而使功能组织得以形成的场所；④能提供临时机械性支持，使新生组织以三维立体结构重建；尤其在早期应能使工程化组织保持理想的稳定性；在后期，需以合适的速度降解而不妨碍组织的渐进性生长。目前，有3类生物材料已应用于组织工程：天然衍化的基质(如胶原、藻酸盐)、去细胞组织材料(如膀胱黏膜下层、小肠黏膜下层、口腔颊黏膜等)和人工合成聚合物，如聚羟乙酸(PolyGlycdic Acid, PGA)、L型聚乳酸(PolyLLactic Acid, PLLA)、L型聚羟乙酸(PolyLGlycdic Acid, PLGA)等。天然衍生和去细胞基质受取材复杂、数量受限的制约。合成材料则可按实际需要的强度、降解速率、微观结构进行大量生产。α羟基酸聚合物(PGA，PLA和PLGA)已广泛应用于组织工程。聚合物中的酯键不稳定，降解无需酶的水解；降解产物无毒，终产物以CO2和H2O的形式排出体外。降解速率可因其结晶性、分子量以及由乳酸到乙酸的共聚速率等因素由数周到数年不等。聚合物具有热塑性，可采用塑型、挤压、溶解铸型、局断分离、气体发泡技术等多种工艺塑造成符合实际需要的微观结构和外部形态。

　　2  组织工程在泌尿系统重建中的应用

　　2.1  尿道修复  以往多采用膀胱黏膜、口腔黏膜、腹膜等治疗尿道下裂、狭窄，存在移植物缩窄、毛发生长、结石形成等多种并发症。1995年Cilento等[2]将混合培养的自体膀胱、尿道上皮和平滑肌细胞种植于具有微小网孔的聚乙酸支架，然后用以修补经剪除形成部分缺损的兔尿道。术后14d组织学检查表明吻合处上皮化，支架开始降解。术后无排尿困难及其它并发症，逆行尿道造影无狭窄迹象。取自膀胱黏膜下层的去细胞胶原基质已成功地应用于试验和临床。Chen等[3]剪除兔腹侧1/2尿道壁，用膀胱黏膜下层的去细胞胶原基质进行修补。组织学证实完全上皮化，并且逐渐有血管和肌纤维长入。试验动物能以修复后的尿道正常排尿。在对尿道下裂和狭窄的患者进行的临床研究中亦得到了证实。Atala等[45]以新鲜尸体膀胱黏膜下层胶原基质先后对人体尿道下裂和狭窄进行修复，取得满意效果。近年有学者[6]以类似方法治疗上述疾病，经过7年随访观察，重建的尿道在结构和功能上非常理想。但以上方法不适用于尿道管状缺损的修复。若需进行管状缺损修复，试用的管状胶原基质上要种植有自身上皮和平滑肌细胞。在雄兔动物模型上，种植了上皮和平滑肌细胞的胶原基质形成了与正常组织结构相似的尿道，发生狭窄等并发症几率降低[2],说明种植有自身尿道上皮和平滑肌细胞的管状胶原基质能成功地应用于全阴茎段尿道的修复。

　　2.2  膀胱替代和修复  目前，胃肠道片段普遍用于膀胱的替代和修复。但是，原本是吸收各种营养物质的胃肠道组织被用作储尿器官难免会有尿内溶质被吸收。要成功地应用细胞移植技术修复膀胱，需依靠合理有效应用供体组织的能力、提供细胞长期生存、分化、生长的环境，尿路和平滑肌细胞能在体外培养、种植于人工合成的聚合物支架上的细胞形成“细胞帘”等。这些技术已成功地应用于动物模型(犬)组织工程化膀胱的建立和替代[7]。尿路和平滑肌细胞分别以活检法取自自身膀胱，然后种植于可降解似膀胱样的聚合物支架上。新生的组织具有正常膀胱壁样结构，造影检查显示其容量高、顺应性好。表明利用组织工程重建结构和功能近似正常的组织工程化膀胱是完全可行的。近年，Atala 等[8]先后为7名4-19岁脊髓脊膜突出症患者(因出现严重膀胱肾盂炎)实施组织工程化膀胱重建。活检法取自患者自身的膀胱壁细胞(包括上皮细胞、肌细胞等)进行体外培养、种植于似膀胱形状的可降解胶原或胶原与聚羟基乙酸复合物支架，7周后回植入患者体内。术后22-61周随访知，平均膀胱漏点压降低、容积增加1.58倍、顺应性增强2.79倍,无代谢性异常和尿路结石形成，黏液产生正常，肾功能得以保护。形成的组织工程化膀胱经活检证实组织结构良好。

　　2.3  治疗膀胱输尿管反流  可注射发泡剂(Injectable Bulking Agents)借助内镜注射于特定部位，能治疗膀胱输尿管反流，具有微创、并发症少等优点。患者于门诊即可施治。包埋有软骨细胞的藻酸盐是最早被应用的可注射生物材料 [9]，其降解速度依各聚糖成分浓度不同而改变。治疗猪膀胱输尿管反流动物模型已获得成功[10]，具有良好抗反流效果且未发现输尿管狭窄证据。在美国已有10个医学中心将以上工程化软骨细胞材料应用于临床治疗人膀胱输尿管反流。患者对这种取自自身的工程化材料表现出良好的相容性[11]。

　　2.4  治疗尿失禁  已有探索可注射肌前体细胞治疗因不可逆性尿道括约肌损伤或发育障碍造成的尿失禁。肌前体细胞是发现于肌纤维静止的卫星细胞，它分化成肌母细胞最终形成肌管和肌肉组织，在修复尿道括约肌损伤中具有积极作用[12]。取自自体的肌前体细胞被注射入尿道括约肌损伤鼠模型，于新生的括约肌组织中发现有肌管替代和功能性运动单位形成[13]，表明肌前体细胞可能成为治疗不可逆性尿失禁的有效方法。

　　2.5  治疗性克隆和干细胞  Lanza等[14]首次报道了利用组织工程和治疗性克隆(核转移)原理培育遗传特性相同肾组织的母牛动物模型。供体牛单个皮肤纤维原细胞被分离并注射入剜除了胞核的卵母细胞周围卵黄囊内。由此干细胞克隆出的肾细胞种植于3个被胶原外衣包裹的圆柱状聚碳酸酩薄膜支架上，每个支架末端与微导尿管连接，微导尿管另一端接入尿液收集器。这样，一个具有尿液收集器的生物工程化结构被植入皮下，12周后取出观察。收集到的尿样液体，经化验表明含有尿素氮、肌酐、电解质、糖等，有特定比重，证实移植的肾细胞具有过滤、重吸收和分泌功能。组织学检查显示，丰富的血管和细胞重建出类似肾小球和肾小管样结构。在肾小球、肾小管和圆柱状聚碳酸酩薄膜间有连续的通道能使尿液流入收集器。免疫组化检测表明肾脏特异性蛋白阳性，RTPCR分析证实在克隆的标本中存在肾特异性RNA转录，Westblot分析肾特异性蛋白水平呈现增高。体内延迟性过敏测试、体外分析分泌γ干扰素的T细胞，均显示对植入的工程化结构无T细胞免疫反应。这说明培育的干细胞经扩增后负载于可降解生物支架一同植入体内，能够新生重建出与宿主遗传学特征相同的新器官[15]。

　　3  总结

　　组织工程学是有机融合多领域的综合性学科，尝试性试验已经涉及泌尿道的各个组织和器官。组织工程学、干细胞学、治疗性克隆(核转移)技术等领域的发展和相互融合必将为人类的修复医学开创出崭新的局面。

【参考文献】　　[1]Yoo JJ, Park HJ, Lee I, et al. Autologous engineered cartilage rods for penile reconstruction [J]. J Urol, 1999, 162:11191121.

　　[2]Cilento BG, Retic AB, Atala A. Urethral reconstriction using a polymer mesh [J]. J Urol, 1995, 153:371A.

　　[3]Chen F, Yoo JJ, Atala A. Acellular collagen matrix as a possible off the shelf' biomaterial for urethral repair [J]. Urology, 1999, 54:407410.

　　[4]Atala A, Guzman L, Retic A. A novel intercollagen matrix for hypospadias repair [J]. J Urol, 1999, 162:11481151.

　　[5]Kassby EA, Yoo JJ, Atala A, et al. A novel intercollagen matrix for urethral stricture repair [J]. J Urol , 2000, 163:308A.

　　[6]EIKassaby AW, Retik AB, Yoo JJ, et al. Urethral stricture repair with an offtheshelf collagen matrix [J]. J Urol, 2003, 169:170173.

　　[7]Oberpenning F, Meng J, Yoo JJ, et al. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering [J]. Nat Biotechol, 1999, 17:149155.

　　[8]Atala A, Bauer SB, Soker S, et al. Tissueengineered autologous bladders for patients needing cystoplasty [J]. Lancet, 2006, 367:12411246.

　　[9]Atala A, Cima LG, Kim W, et al. Injectable alginate seeded with chondrocytes as a potential treament for vesicoureteral reflux [J]. J Urol, 1993, 150: 745747.

　　[10]Atala A, Kim W, Paige KT, et al. Endoscopic treatment of vesicoureteral reflux with a chondrocytealginate suspension [J]. J Urol, 1994, 152:641643.

　　[11]Diamond DA, Caldamone AA. Endoscopic correction of vesicoureteral reflux in children using autologous chondrocytes: Preliminary Results [J]. J Urol, 1999, 162:11851188.

　　[12]Yiou R, Lefaucheur JP, Atala A. The regeneration process of the striated urethral sphincter involves activation of intrinsic satellite cells [J]. Anat Embryol(BERL), 2003, 206:429435.

　　[13]Yiou R, Yoo JJ, Atala A. Restoration of functional motor units in a rat model of sphincter injury by muscle precursor cell autografts [J]. Transplantation, 2003, 76:10531060.

　　[14]Lanza RP, Chung HY, Yoo JJ, et al. Generation of histocompatible tissues using nuclear transplantation [J]. Nat Biotechnol 2002, 20:689696.

　　[15]Auchincloss H, Bonventre JV. Transplanting cloned cells into therapeutic promis [J]. Nat Biotechnol 2002, 20:665666.