BRP44基因对前列腺癌生物学行为的影响

作者：袁刚，李黔生，靳风烁，蒋小娟，吴 刚    作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042

【摘要】  目的 研究BRP44高表达的人前列腺癌细胞PC3细胞系(雄激素非依赖性前列腺癌细胞株)细胞的生物学性状的影响，以了解其在人前列腺癌发生发展中可能的机制和作用。方法 将已转染BRP44的PC3细胞提取其RNA，进而行Northern Blot检测证明其高表达，用Alamar Blue检测BRP44高表达的阳性细胞生长情况，流式细胞仪检测其细胞周期变换，采用改良的Transwell侵袭小室方法检测细胞侵袭能力。结果 BRP44高表达的PC3细胞增殖速度较转染空载体的PC3细胞和正常PC3细胞快，差异有统计学意义(P<0.05)。在体外细胞移动实验中，BRP44高表达的PC3细胞也较另两组细胞表现出更强的穿膜能力、侵袭力(P<0.01)。结论 BRP44表达增高与人前列腺癌细胞的恶性表型具有密切相关性，BRP44可能在人前列腺癌的发生、发展中发挥重要作用。

【关键词】  BRP44；人前列腺癌；PC3细胞；增殖；侵袭

     前列腺癌是全世界特别是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。我国随着人口老龄化、生活习惯及医疗检测水平的提高，目前发病率正逐年上升。我们基于SAGE数据库获得了前列腺癌与正常组织的差异表达基因，确定功能完全未知的BRP44基因为进一步研究的兴趣基因。通过Northern Blot实验证实：BRP44在前列腺癌细胞(LNCaP)中高表达而在PC3细胞中不表达。通过生物信息学方法，我们初步推断BRP44可能是一个在转录或翻译水平控制肿瘤细胞线粒体某些基因表达的调控因子[1]。RNA干扰实验证实BRP44基因对LNCaP细胞(雄激素依赖性前列腺癌细胞)的生长增殖起着负向调节作用。而在前列腺癌细胞PC3细胞(雄激素非依赖性前列腺癌细胞)中不表达。因此我们通过转染使BRP44基因在PC3细胞中高效稳定表达，研究BRP44PC3细胞的生物学性状的改变，初步了解BRP44基因的功能。

    1  材料与方法

    1.1  材料  PC3细胞系购买于中国科学院上海细胞研究所；细胞培养用的培养基小牛血清＋1640培养基(Hyclone公司),DNA限制性内切酶BamHⅠ、EcoR Ⅰ(TaKaRa公司)，PCR所用试剂(TaKaRa公司)，pcDNA3.1/mycHis A(大坪医院吴刚博士馈赠)，alarmar blue(SAGE公司)。

    1.2  稳定高表达的PC3细胞系的建立及鉴定  采用pcDNA3.1/mycHis A载体与BRP44构建成重组子，pcDNA3.1/mycHisA载体与BRP44配合脂质体Lipofectamine 2000转染PC3细胞。预实验发现按5000细胞/皿稀释的3.5cm培养皿的细胞单克隆数量最为理想，于超净工作台上用20μL微量移液管管尖压住细胞克隆，将细胞克隆移至24孔板，胰酶消化后继续用含300μg/L的G418培养基培养，5-8d后转入6孔板，待细胞长到80%后转入25cm2培养瓶，培养稳定传代后一部分冻存[2]。

    对于外源基因转录表达强度的检测，一般采用Western Blot或者ELISA检测其蛋白表达的强弱，由于BRP44是一条功能完全未知的基因，无现成的的抗体可用。Northern Blot是分析mRNA表达丰度的可靠方法，由于该方法直接检测mRNA，不需反转录过程，只要保证RNA提取的质量及转膜的效率即可，因此以GAPDH为参照的定量分析结果的可靠性远优于RTPCR[3]。采用RTPCR和Northern Blot两种检测方法对转染后的细胞亚克隆进行检测，均可达到预期效果[4]。

    1.3  Northern检测  将已转染成功的PC3细胞培养稳定。按照Trizol试剂说明提取细胞总RNA，经过分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测质量，选用合格的RNA样本进行分析。在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳，每个加样孔点10μg RNA，8V/cm电泳3h。上行毛细管转移法将RNA转移至带正电荷的尼龙膜上[5]，转移12h后80℃烤干2h进行杂交。采用cDNA Prime试剂盒随机引物法合成BRP44的同位素标记探针。杂交12h后放射自显影48h洗片。

    1.4  细胞增殖的测定  将处于对数生长期的稳定高效表达BRP44的PC3细胞(A组)和正常PC3细胞(B组)分别用胰蛋白酶消化后并细胞计数；按每孔200μL(控制细胞密度为2000细胞/孔)分别将A组和B组细胞种植于96孔板中，每组细胞分别设定12组，每孔细胞长满80%-90%后，C组12孔加入相同量的培养基作为比色的调零；每日定点加入Alamar Blue 20μL，然后放入37℃、5% CO2细胞孵箱培养4h后，用酶标读数仪读取每孔在570nm及600nm波长的光吸收值。根据还原量公式：还原量%＝117216×(T570)-80586×(T600)/155677×C600)-14652×(C570)分别测量A组和B组细胞的还原量。T570=测试组在570nm时A、B组的吸收值；T600=测试组在600nm时A、B组的吸收值；C570=对照组在570nm时C组的吸收值；C600 =对照组在600nm时C组的吸收值[6]；连续5d。分别以每日A、B组Alamar Blue被还原量的均值百分比为纵坐标，天数为横坐标，绘制细胞生长曲线[6]。

    1.5  流式细胞仪监测细胞周期分布  收获处于对数生长周期的高表达BRP44的PC3细胞 (A组)和正常PC3细胞(B组)，用胰蛋白酶消化后细胞计数，调整细胞浓度到109/L，流式细胞仪测定细胞荧光强度，得到细胞DNA含量分布直方图；用软件进行分析各个周期的分布比例，并以此来判读A、B两组细胞周期变化[7]。

    1.6  细胞侵袭力测定  采用改良的Transwell侵袭小室法检测BRP44及正常PC3细胞侵袭能力。Transwell小室滤膜上均匀涂体积比为1∶8的1640稀释的人基质M atrigel(B.D公司)约50μg/小室。制备好的小室用紫外线照射2h杀菌，使用前加入少量无血清的1640培养基水化。小室下室加入0.5mL含1%胎牛血清的1640，上室加入含10%胎牛血清25μL并接种细胞，每孔接种10000个细胞，每组3个复孔。37℃、5% CO2培养48h，取出小室，PBS液淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，95%乙醇固定，0.5%亚甲蓝染色，在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野。

    1.7  统计学方法  实验数据均以±s表示，细胞增殖和侵袭能力的组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  稳定表达 BRP44的PC3细胞鉴定  取转染后PC3细胞的总RNA反转录成cDNA的第一链，经梯度PCR仪设定PCR程序后电泳鉴定，见图1、2。

    图1  1、3、4：转染pcDNA3.1/mycHisABRP44的细胞亚克隆；2、5-11：转染pcDNA3.1/mycHisA空载体的细胞亚克隆

    Northern Blot是分析mRNA表达丰度的可靠方法，我们通过Northern检测证实，G418筛选出的4个细胞亚克隆有不同程度的目的基因表达，图中的第1个细胞亚克隆表达的BRP44最强,而转染空载体的细胞亚克隆(第2道)无BRP44基因表达。

    实验对BRP44基因目的片段的PCR扩增产生的特异性条带约500bp，与预计片段大小相同。将RTPCR的片段进行测序，序列分析显示序列与已经公布的BRP44基因的核苷酸序列完全一致，插入片段位置及方向性正确，表明稳定高表达BRP44的PC3细胞构建成功，可以进行下一步转染细胞生物学性状的研究。

    图2  外源BRP44在PC3细胞亚克隆的表达

    1、3-6：转染BRP44的PC3 细胞亚克隆；2：转染空载体的PC3细胞亚克隆

    2.2  细胞增殖情况  采用Alamar Blue法绘制PC3BRP44、PC3空载体﹑正常PC3细胞3组细胞生长曲线(图3)，结果显示：随着时间的延长，3组细胞的增殖不断增强，PC3BRP44组的增殖能力最强。由表1、2可见，培养72h后BRP44PC3组细胞较转染空载体的细胞及未转染的PC3细胞增多，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

    流式细胞仪检测BRP44PC3、正常PC3细胞水平结果：由表1可见PC3BRP44(A组)72h后较正常PC3细胞(B组)的细胞周期发生了显著变化，主要表现为S期细胞显著增加，而G0＋G1、G2＋M期细胞显著减少。即高表达BRP44的PC3细胞处于稳定分裂期的细胞较多，细胞增殖能力增强。

    图3  Alamar Blue法绘制细胞生长曲线表1  BRP44PC3细胞(A组)、正常PC3细胞(B组)的细胞周期分布

    细胞周期G0＋G1 (%)S (%)G2＋M (%)A组45.2±3.1548.6±3.245.2±0.46B组52.3±2.6527.4±1.5616.5±1.12P值<0.05<0.05<0.05

    2.3  细胞侵袭情况  采用Transwell侵袭小室方法检测细胞侵袭能力，表明BRP44高表达的PC3细胞(A组)较PC3空载体细胞(B组)，未转染的PC3细胞(C组)移至微孔膜下层的细胞数增多，差异均有统计学意义(t=11.236、12.105, P<0.01)，说明PC3BRP44细胞侵袭能力加强。表2  两组细胞增殖情况和侵袭能力的比较

    通过细胞侵袭力的检测，我们发现BRP44高表达的PC3细胞(A组)较PC3空载体细胞(B组)、未转染的PC3细胞(C组)移动侵袭能力增强。

    3  讨    论

    前列腺癌研究中，差异表达基因可以是细胞发生恶变的重要原因，也可以是细胞发生恶变后的结果。但无论因果，差异表达基因都是探究前列腺癌致病机理的重要线索[8]。我们在前期实验中发现，BRP44在前列腺癌组织的表达丰度高于良性前列腺瘤组织，BRP44在LNCaP细胞中高表达而在PC3细胞中不表达，推断BRP44可能是一个与前列腺癌相关的上调表达基因。

    通过对BRP44基因的功能检索，我们发现BRP44是一条功能完全未知的基因。在前期实验中，我们抑制BRP44在LNCaP细胞中的表达后，发现LNCaP细胞的增殖能力增强[9]，因此我们初步推断BRP44对LNCaP细胞的生长起负向调控作用。

    临床研究证实，相对于雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)，雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC3)的恶性度更高、远处转移能力更强、时间更早。但BRP44在PC3细胞中不表达。我们通过转染的方法将外源的BRP44基因转染进PC3细胞，并且稳定高表达。进而检测转染BRP44并稳定高表达的PC3细胞的生物学性状的变化，初步认为BRP44是一个与前列腺癌发生发展密切相关的上调表达基因。

    采用pcDNA3.1/mycHisA载体与BRP44构建重组子，脂质体Lipofectamine2000转染PC3细胞，并通过G418筛选出BRP44PC3细胞。Northern Blot证实其稳定高表达。因此我们采用检测转染外源基因的肿瘤细胞常用的方法：肿瘤细胞的增殖能力、侵袭力、裸鼠致瘤率等来推断基因的功能[10]。

    Alamar Blue法构建生长曲线发现，当细胞培养稳定后，BRP44PC3细胞还原量最高。流式细胞仪测定细胞周期发现，细胞稳定后，PC3BRP44细胞较正常PC3细胞S期细胞显著增加，即BRP44PC3细胞较正常PC3细胞有更强DNA合成能力、更强的细胞分裂增殖能力[11]。采用改良的Transwellie小室法检测发现，BRP44高表达的PC3细胞较正常PC3细胞侵袭力更强。由此可见外源性BRP44基因可以显著促进PC3细胞的增殖、侵袭力。

    尽管肿瘤细胞增殖调控是一个涉及多因素、多环节的复杂过程，但在细胞增殖调控中，大多数原癌基因促进和发挥正调控作用，而抑癌基因则起抑制与负调控作用。我们也可以认为BRP44基因可能是前列腺癌的上调表达基因。我们在前期siRNA干扰LNCaP细胞中BRP44基因表达的实验中证实，下调BRP44基因的表达会促进LNCaP细胞的增殖从而起负向调节作用，另外研究证实在体外环境下外源性BRP44基因对人前列腺癌中PC3细胞的细胞增殖和侵袭力有明显增强作用[12]。上调表达基因主要是雄激素通路及物质代谢相关基因、细胞生长正向调节因子及转录因子，这与前列腺癌的雄激素依赖性、代谢旺盛、生长迅速等特点是相适应的。因此BRP44的表达可能是前列腺癌细胞分裂增殖、侵袭转移的一个正性调控因子，BRP44基因可能是和前列腺癌相关的抑癌基因。如发现有效阻断其表达的途径，将会具有潜在的临床应用价值，这也将会为进一步开展前列腺癌的基因诊断、基因治疗提供新的关注点。

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