肾透明细胞癌中VHL基因改变和趋化因子受体CXCR4的表达及相关性

    作者：曹正国，孙友文，诸禹平，樊龙昌，苏 红，舒启安    作者单位：安徽医科大学附属省立医院泌尿外科，安徽合肥 230001

    【摘要】  目的 研究肾透明细胞癌(CCRCC)组织中Von Hippel-Lindau(VHL)基因改变和趋化因子受体CXCR4的表达及其相关性，探讨VHL基因在CCRCC中的作用。方法 分别采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析、微卫星法、DNA甲基化特异性PCR和半定量逆转录PCR检测35例CCRCC和20例正常肾组织中VHL基因突变、杂合性缺失(LOH)、异常甲基化及CXCR4 mRNA的表达。结果 VHL基因在CCRCC和正常肾组织中的改变率分别为74.29%、5.0%，二者的差异有统计学意义(χ2=24.45，P<0.01)；VHL基因改变与CCRCC的临床分期、淋巴转移等密切相关(χ2=4.05、5.18，P均<0.05)，而与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤大小等均无相关性(P>0.05)。CXCR4 mRNA在CCRCC中的表达率为77.14%，显著高于正常肾组织的5.0%；CXCR4的表达与CCRCC的病理分级、淋巴转移密切相关(χ2=7.35、4.24，P均<0.05)，而与其他临床病理特征等均无相关性。相关性检验表明CCRCC中VHL基因改变与CXCR4的表达密切相关(χ2=3.89，P<0.05)。 结论 VHL基因突变和LOH导致其失活是CCRCC发生的重要分子机制，VHL基因和CXCR4可作为判断CCRCC预后的重要参考指标，并可负向调节CXCR4的表达。

    【关键词】  肾透明细胞癌；VHL基因；趋化因子受体(CXCR4)；失活；甲基化；突变

    肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, CCRCC)是肾脏最常见的恶性肿瘤。虽然遗传学研究表明3号染色体短臂(3p)的缺失和易位与肾癌发生有关，但其分子机制尚不完全清楚。Von Hippel-Lindau(VHL)基因是Latif等［1］在1993年从VHL家族中成功克隆出来的一种肿瘤抑制基因，定位于3p25-26，全长约15kb，包含有3个外显子和2个内含子。大量研究证实VHL基因与肿瘤细胞生长、增殖及分化关系密切，在恶性肿瘤的诊断和治疗上具有重要的应用价值。趋化因子受体(chemokine receptor, CXCR4)是一种广泛存在于不同类型细胞表面上的G蛋白偶联受体。近年来的研究发现CXCR4在多种肿瘤细胞中表达并可能在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。本文分别采用微卫星标志法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction single-strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、DNA甲基化特异性PCR(methylation-specific, MSP)和半定量逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)检测CCRCC和正常肾组织中VHL基因突变、3p的杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)、异常甲基化与CXCR4 mRNA的表达及二者的相关性，探讨VHL基因改变在CCRCC中的作用及其机制。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  收集我院和同济医院泌尿外科2004年1月-2006年12月手术切除并经病理证实的35例原发性非遗传性CCRCC患者的新鲜组织标本。所有患者术前均未行任何化疗、放疗，其中男性20例，女性15例；年龄33-75岁，平均(55.6±8.1)岁；左肾22例，右肾13例。癌组织取肿块非坏死部分，参照Fuhrman病理分级：Ⅰ级14例、Ⅱ级11例、Ⅲ级10例；Robson临床分期：Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。20例正常肾组织取自肾结石行肾切除术后的标本。所有组织标本均为严格无菌采集后立即置-80 ℃冰箱保存备用。

    1.2  主要试剂  基因组DNA提取试剂盒，武汉博士德公司产品；Trizol试剂，Gibco公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPs、TaKaRa RNA PCR (AMV) Ver 3.0 试剂盒，大连宝生物工程有限公司产品；Wizard Genomic DNA Purification试剂盒，Promega公司产品。

    1.3  方法

    1.3.1  组织基因组DNA和总RNA提取  取以上每份标本25-50 mg置于玻璃匀浆器碾碎后，基因组DNA和总RNA的提取步骤按照DNA提取试剂盒和Trizol试剂的说明书进行。紫外分光光度计检测提取的A260/A280均在1.8-2.0之间。

    1.3.2  PCR扩增组织基因组DNA  VHL基因外显子exon1、exon2、exon3的引物序列参照文献［2］。在50 μL标准的PCR体系中加入基因组DNA 200 ng，PCR反应条件为94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环后72 ℃延伸5 min。

    1.3.3  PCR-SSCP分析VHL基因突变  取10 μL PCR产物，加10 μL的甲酰胺变性上样缓冲液混匀，95 ℃变性5 min，冰浴骤冷2-3 min后迅速上样至80 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶，室温下300 V电泳1.5-3 h，常规硝酸银染色，干燥凝胶并摄片。结果判断：若泳动条带的位置移位则判定为基因突变。

    1.3.4  微卫星法分析LOH  采用PCR对3p VHL基因位点的微卫星标志D3S1038及其相邻位点微卫星标志D3S1110、D3S1350和D3S656进行扩增，方法参照文献［3］。PCR反应条件为94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环。扩增产物变性后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，观察条带有无杂合性缺失。

    1.3.5  甲基化特异性PCR(MSP)分析基因异常甲基化  采用MSP法［4］。基因组DNA经亚硫酸氢钠修饰后，再经Wizard Genomic DNA Purification试剂盒纯化。最后采用特异性的甲基化引物和非甲基化引物对修饰后的DNA进行扩增来检测待扩增片段的甲基化状态，扩增引物序列参见文献［2］。出现VHLM 扩增产物说明该片段已发生了甲基化，出现VHLU扩增产物说明该片段未发生甲基化。

    1.3.6  RT-PCR检测CXCR4 mRNA表达  根据Primer 5.0软件设计VHL上游引物序列：5′-TCTCGGTCCACTCTTGTT-3′，下游引物序列：5′-GCCACTCAGGAGGATTAC-3′，预计扩增产物为362 bp。RT反应条件：55 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，PCR反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环30次。PCR反应结束后，取5 μL扩增产物在含溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用UVP-GDS 8000凝胶成像系统扫描并测定CXCR4的阳性表达率。

    1.4  统计学分析  采用SPSS 11.5统计软件包分析，选择性采用χ2检验、Fisher精确概率法和t检验，检验水准为α＝0.05。

    2  结    果

    2.1  VHL基因改变  CCRCC中VHL基因总突变率为48.57%(17/35)、单个突变率为11.43%(4/35)，总LOH发生率为57.14%(20/35)、单个LOH发生率为20.0%(7/35)，甲基化发生率为5.71%(2/35)，其中13例同时发生基因突变和LOH(37.14%)，肾癌VHL基因总改变率为74.29%(26/35)，与正常肾组织5.0%(1/20)相比，二者差异有统计学意义(χ2=24.447，P＝0.000)。

    2.2  CXCR4的表达  CXCR4 mRNA在CCRCC和正常肾组织的表达率分别为77.14%(27/35)、5.0%(1/20)，二者差异有统计学意义(χ2=26.505，P＝0.000)。

    2.3  VHL基因改变、CXCR4表达与CCRCC临床病理特征的关系  VHL基因失活与CCRCC患者的性别、年龄、肿瘤大小等均无相关性(P>0.05)，而与淋巴转移密切相关(χ2=5.178，P＝0.023)；由于Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅳ期间的差异均无统计学意义，将低分期组(Ⅰ、Ⅱ期)和高分期组(Ⅲ、Ⅳ期)比较，二者之间具有统计学意义(χ2=4.051，P＝0.044)。CXCR4的表达与性别、年龄、肿瘤大小、临床分期等均不相关，而与淋巴转移密切相关(χ2=4.239，P＝0.040)；由于Fuhrman分级对Ⅱ级和Ⅲ级CCRCC的指导意义不大，故参照Fuhrman的方法，将Ⅱ级和Ⅲ级合并后，Ⅰ级与Ⅱ＋Ⅲ级之间具有统计学意义(χ2=7.352，P＝0.007，表1)。表 1  VHL基因失活及CXCR4表达与CCRCC临床病理特征的关系注：Ⅰ与Ⅱ＋Ⅲ比较、Ⅰ＋Ⅱ与Ⅲ＋Ⅳ比较、淋巴转移与无转移比较，*P<0.05

    2.4  CCRCC中VHL基因失活和CXCR4表达的相关性  VHL基因失活在CCRCC中CXCR4阳性表达中的发生率为84.62%，CXCR4阳性表达中VHL基因未改变率为55.56%，相关性分析表明VHL基因失活和CXCR4表达密切相关(表2)。表2  CCRCC中VHL基因失活和CXCR4表达的相关性

    3  讨    论

    研究发现VHL基因编码产生的VHL蛋白既可通过“VHL/缺氧诱导因子(HIF)通路”介导降解HIF后，间接地抑制各生长因子的转录；又可与转录延伸因子(Elongin)B-C、CUL2 蛋白组成VBC复合物，通过抑制RNA聚合酶II的活性直接抑制基因转录，从而发挥抑癌作用［5］。一旦VHL基因失活即可导致这些功能的丧失和肿瘤的发生、发展。我们发现在35例CCRCC患者不同的临床分期中均可以检测到VHL基因突变，总发生率为48.57%。由于PCR-SSCP不能检测出所有类型的基因突变以及肿瘤基因组DNA中可能混有正常基因组DNA而出现假阴性，因此，实际发生的突变率应更高。国内外报道CCRCC的VHL基因突变率为50%-80%［6］，说明VHL基因突变是CCRCC发生的早期事件。Velickovic等［7］研究发现CCRCC、嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌的LOH发生率分别为75.8%、86.6%、59%，三者之间无显著性差异，因此LOH的高发生率可能是肾癌不同亚型所共有的特点，也是CCRCC发生的早期事件。此外，VHL基因的甲基化也是导致基因失活的一个重要原因。大部分学者用Southern blot的方法发现肾癌中VHL基因的甲基化发生率约为10%，而且甲基化的发生对CCRCC来说是特异性的。而我们采用MSP检测的甲基化发生率为5.71%。Meyer等［8］认为这种差异主要是实验方法所造成的，Southern blot容易产生假阳性，而MSP目前则被认为是检测基因甲基化的金标准。因此，大多数学者对CCRCC中VHL基因甲基化的发生情况仍有争议，但都认为CCRCC中存在VHL基因的甲基化。目前普遍认为人类肿瘤的发生机制是“二次打击”学说，该学说为肿瘤细胞中抑癌基因的失活方式做出了合理解释。基因突变通常为第一次打击机制，而第二次打击的机制则为LOH。由于CCRCC中VHL基因突变和LOH的广泛存在，我们认为VHL基因的失活符合肿瘤“二次打击”学说。

    CXCR4是基质细胞衍生因子(stroma cell derivation factor, SDF-1)的受体。最新研究显示CXCR4/SDF-1构成的生物学轴参与调控肾癌的转移［9］。同时研究已证实HIF可通过调节CXCR4参与肿瘤的转移过程，VHL缺陷的人胚肾细胞系中存在着CXCR4的高表达［10］。本研究结果显示CXCR4在CCRCC的表达率高达77.14%，与病理分级、淋巴转移密切相关，且VHL基因失活与CXCR4表达呈正相关，提示CXCR4受VHL基因的负调控，这可能是VHL蛋白通过降解HIF从而抑制CXCR4的转录和表达。

    本研究结果表明50%以上的CCRCC中广泛存在VHL基因突变和LOH，并有一定的甲基化发生率，故我们认为VHL基因突变、LOH以及甲基化所致VHL基因失活是非遗传性散发性CCRCC发生的重要分子机制。VHL基因失活与CCRCC的临床分期、淋巴转移等密切相关，说明VHL基因的改变可作为CCRCC的独立预后因素，这与其他学者的研究结果也是相似的［11］。同时CXCR4表达与病理分级、淋巴转移密切相关，且受VHL基因的负调控。通过对VHL基因失活和CXCR4表达的检测有望成为早期诊断CCRCC和监测CCRCC复发的标志物，在治疗选择和预后判断都有重要的临床意义。因此，随着对VHL基因和CXCR4研究的深入，将为CCRCC的诊断和治疗开辟一条新的途径。

【参考文献】［1］Latif F, Tory K, Gnarra J, et al. Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene ［J］. Science, 1993, 260(5112):1317-1320.

［2］Kim JH, Jung CW, Cho YH, et al. Somatic VHL alteration and its impact on prognosis in patients with clear cell renal cell carcinoma ［J］. Oncol Rep, 2005, 13(5):859-864.

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［4］Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(18):9821-9826.

［5］Haase. The VHL/HIF oxygen-sensing pathway and its relevance to kidney disease ［J］. Kidney Int, 2006, 69(8):1302-1307.

［6］潘家骅, 刘维明, 黄冀然, 等. von Hippel-Lindau病家系调查及基因学研究［J］.中华泌尿外科杂志, 2006, 27(suppl):5-8.

［7］Velickovic M, Delahunt B, Storkel S, et al. VHL and FHIT locus loss of heterozygosity is common in all renal cancer morphotypes but differs in pattern and prognostic significance ［J］. Cancer Res, 2001, 61(12):4815-4819.

［8］Meyer AJ, Hernandez A, Florl AR, et al. Novel mutations of the von hippel-lindau tumor-suppressor gene and rare DNA hypermethylation in renal-cell carcinoma cell lines of the clear-cell type ［J］. Int J Cancer, 2000, 87(5):650-653.

［9］Pan J, Mestas J, Burdick MD, et al. Stromal derived factor-1 (SDF-1/CXCL12) and CXCR4 in renal cell carcinoma metastasis ［J］. Mol Cancer, 2006, 3(5):56-70.

［10］Staller P, Sulitkova J, Lisztwan J, et al. Chemokine receptor CXCR4 downregulated by von Hippel-Lindau tumour suppressor pVHL ［J］. Nature, 2003, 425(6955):307-311.

［11］程帆, 张孝斌, 张杰, 等. 肾细胞癌VHL基因改变与VEGF表达的关系及意义［J］.中华泌尿外科杂志, 2001, 22(10):587-590.