环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3表达的影响

作者:王云,魏旭峰,顾继伟作者单位：第四军医大学西京医院心血管外科，陕西西安 710032；宁夏医学院附属医院心胸外科，宁夏银川 750004

   【摘要】  目的 探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3(matrix metalloproteinase1、3, MMP1、3)表达的影响。方法 采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组，用30g/L环氧氯丙烷处理24h的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)种植于脱细胞支架上的组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve, TEHV)，分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构，并行RTPCR测定hBMSCs分泌MMP1、3的功能。结果 hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMPs的表达比对照组降低。结论 环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架，可以抑制hBMSCs的MMP1、3的表达。

【关键词】  环氧氯丙烷；基质金属蛋白酶；组织工程心脏瓣膜；降解代谢

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30471716)

　　The expression of matrix metalloproteinase 1 and 3 affected　by epoxy chloropropane in creating tissue engineering heart valves

　　Wang Yun, Wei Xufeng, Gu Jiwei, Li Qingxin, Chen Yu, Yi Dinghua

　　(Department of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xian 710032; Department of Cardiovascular Surgery,Ningxia Medical College Hospital, Yinchuan 750004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To evaluate the effects of epoxy chloropropane on the expression of matrix metalloproteinase 1 and 3 in creating tissue engineering heart valves. Methods  The porcine aortic valve leaflets were digested by using detergent and trypsin as control group, and those decellularized leaflets treated with 3% epoxy chloropropan for 24 hours were the experimental group. The cultured human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) were seeded onto the decellularized scaffolds of TEHV. The histological study was conducted with pathological sections and scanning electron microscopy. And reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the expression of MMP1 and 3. Results  In the experimental group, the histology showed that the hBMSCs grew well into the pores and formed a confluent layer in decellularized scaffolds; RTPCR indicated significantly attenuated expression of MMP1 and 3 compared with the control (P<0.05). Conclusion  The decellularized porcine aortic valve leaflets treated by epoxy chloropropane may inhibit the expression of MMP1 and 3 of hBMSCs.

　　KEY WORDS: epoxy chloropropane; matrix metalloproteinase; tissue engineering heart valve; degradation

　　生物瓣膜长期植入人体后的钙化使其易于衰坏，影响了生物瓣的广泛应用[12]。其细胞外基质成分会受到内源性蛋白水解酶和宿主蛋白水解酶的降解，这可能是生物瓣膜衰坏和钙化的原因之一。细胞外基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是最主要的蛋白水解酶，多种细胞分泌MMPs。环氧氯丙烷(epoxy chloropropane, EC)是经筛选的生物瓣膜防钙化剂。动物实验证明EC能使戊二醛处理的瓣膜钙化明显减轻，仅为对照组的1/317，且瓣膜的力学性能和组织稳定性良好[34]。在组织工程瓣膜研究中，应用EC处理脱细胞猪瓣支架材料毒性低，初步实验研究证实种子细胞能够生长。本文通过RTPCP技术测定两组MMP1和MMP3基因的表达情况，比较去垢剂和胰蛋白酶共同消化以及加用EC处理这两种不同方法，并对后者的作用予以评价。

　1  材料与方法

　　1.1  动物和试剂  猪心30个购自西安肉联厂，DF12培养基和FCS购自Gibco公司，鼠抗人αSMA抗体购自Sigma公司，Vimentin抗体购自Neomaerker公司，辣根酶标记山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，含10%(体积分数)FCS的DF12培养液，青霉素80u/mL，链霉素100u/mL。

　　1.2  人BMSCs的分离和培养  人BMSCs来源于5名先天性心脏病患者，平均年龄(4±0.1)岁，均为家属知情同意。胸骨劈开后，在胸骨断面负压吸引，用预置10mL肝素盐水(200u/mL)的注射器吸取10mL骨髓，充分混匀，400×g离心5min，弃去脂肪层，分别沿管壁注入2支含10mL Percoll分离液(密度为1.073g/mL)的一次性离心管内，立即1000×g离心20min；抽取界面处细胞悬液，400×g离心5min；弃上清，吹打成细胞悬液，接种于75cm2培养瓶，加入DF12培养液，置于37℃恒温保湿培养箱中培养。24h与72h换液，逐步除去未贴壁细胞，此后每3d换液一次。当细胞达90%融合时，以2.5g/L胰酶消化传代，取第二代细胞行细胞表型鉴定，第三代以后的用于瓣膜种植。　　　　1.3  细胞表型的鉴定  取第二代细胞接种于预入盖玻片的75cm2培养瓶中，贴壁3h后加入DF12培养液，次日取出玻片，PBS液冲洗3次，40g/L多聚甲醛固定。按常规免疫组化方法，加入鼠抗人Vimentin及αSMA抗体，DAB试剂盒显色鉴定细胞表型。

　　1.4  脱细胞猪主动脉瓣支架的制作  清洁条件下，取出猪主动脉瓣，将新鲜瓣叶加入含1g/L胰酶及双抗溶液(100u/mL青霉素及100μg/mL链霉素溶液)的PBS液于25℃水浴摇床中连续振荡12h，制备猪脱细胞主动脉瓣支架[5]。含双抗的PBS液冲洗脱细胞猪瓣后取样，于40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片常规HE染色行组织学检查，其余瓣叶置于灭菌的广口瓶中，封口后送钴源室辐照消毒(Co6012000Gy照射12h)，常温保存备用。

　　1.5  TEHV的构建  将脱细胞瓣叶放入12孔板中(每孔1片)，以FCS浸泡24h，滴种BMSCs细胞悬液(1×105/cm2)，贴壁3h后加入适量培养液，培养7d，每天换液一次。

　　1.6  组织学的检查  取出TEHV瓣叶，PBS液轻轻冲洗后分2组(每组6片)，以40g/L多聚甲醛固定，行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜检查。

　　1.7  RTPCR检测  按总RNA 抽提的程序进行总RNA抽提(RNA抽提试剂盒购自TaKaRa生物公司)。分别设计并合成特异性扩增MMP1和MMP3基因的寡核苷酸引物，用RTPCR试剂盒(TaKaRa)进行扩增。MMP1(346bp)正义与反义两条引物的序列分别为：5′CATCGTGTTGCGGCTCAT3′，5′GCCCATTTGGCAGTTGTG3′。MMP3(312bp)正义与反义两条引物的序列分别为：5′AGTTTGCTCAGCCTATCC3′，5′CTGTATGTAAGGTGGGTTT3′。扩增反应条件为：逆转录42℃、1h；PCR 94℃、5min；94℃、30s；60℃、45s；72℃、60s；72℃、5min共35个循环。理论上扩增片段大小分别位于346bp及312bp。

　　1.8  PCR产物分析  分别取6μL产物，于10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。用βactin(310bp)作为内对照，上下游引物分别为：5′ATCATGTTTGAGACCTTCAA3′，5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′。用Labwork软件进行半定量分析，测定其相对含量。

　　1.9  统计学处理  利用SPSS软件进行统计学分析，所有数据用±s表示，两组间比较用t检验。

　　2  结果

　　2.1  BMSCs的培养及分化  BMSCs原代培养24h后基本完全贴壁，48-72h即可见克隆形成，细胞逐渐呈梭形，8-12d已达80%融合。传代培养的细胞数小时后贴壁并伸展成多角形、梭形，3-5d完全融合，传代细胞Vimentin及αSMA染色阳性(图1、2)。

　　2.2  脱细胞支架的组织学结构  瓣叶表面及中间的细胞成分完全去除，胶原纤维及弹力纤维结构完整、呈波浪状(图3)。

　2.3  TEHV的组织学和扫描电镜检查  实验组与对照组相比，HE染色显示BMSCs分化细胞在脱细胞支架上呈复层生长，细胞间有基质形成。脱细胞支架表面为致密细胞层覆盖，细胞呈梭形，排列有序(图4-7)。

　　2.4  MMP1和MMP3的mRNA表达  RTPCR产物经琼脂糖电泳分析显示MMP1和MMP3扩增片段分别位于为346bp和312bp。实验组与对照组相比，培养的hBMSCs在两基因的mRNA表达方面均降低，有明显差异(P<0.05，图8)。    　　图1  骨髓干细胞免疫组化染色显示波形为蛋白抗体阳性（略）

　　Fig.1 The immunohistochemistry of hBMSCs showed positive vimentin antibody (×200)

　　图2  骨髓干细胞免疫组化染色显示α平滑肌抗体阳性（略）

　　Fig.2 The immunohistochemistry of hBMSCs showed positive αSMA (×200)

　　图3  脱细胞猪主动脉瓣叶的组织结构（略）

　　Fig.3 The hematoxylin and eosin staining of decellularized porcine aorta valve leaflets (×400)

　　图4  实验组构建的TEHV的HE染色结果（略）

　　Fig.4 The hematoxylin and eosin staining of TEHV on the experimental group (×400)

　　图5  对照组构建的TEHV的HE染色结果（略）

　　Fig.5 The hematoxylin and eosin staining of TEHV on the control group (×400)

　　图6  实验组构建的TEHV的扫描电镜结果（略）

　　Fig.6 The scanning electron microscope section of TEHV on the experimental group (×1500)

　　图7  对照组构建的TEHV的扫描电镜结果（略）

　　Fig.7 The scanning electron microscope section of TEHV on the control group (×1500)　　　　图8  两组分别构建的TEHV的RTPCR结果（略）

　　Fig.8 The results of RTPCR on TEHV in two groups

　　M: marker; Line 3, 6: blank; Line 1,4,7: products of MMP1, 3 and βactin in the control group; Lane 2,5,8: products of MMP1, 3 and βactin in the experimental group. They were 346bp, 312bp and 310bp, respectively

　　3  讨论    　　　　心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜病的主要方法。但是，临床应用的人工瓣膜的远期效果尚不令人满意。近年来，随着组织工程学技术的进展，利用培养的自身组织细胞种植于支架材料表面，体外重建理想的心脏瓣膜移植物日益成为研究热点，并取得一定进展。支架材料主要承担瓣膜力学构型和细胞黏附载体的作用。它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适应、结合、修复和替代的效果，是限制组织工程能否真正应用于临床的一个关键因素[6]。应用去细胞猪主动脉瓣支架与BMSCs在体外构建组织工程瓣膜具有可行性[7]。组织工程瓣膜组织的主要成份为胶原纤维和弹力纤维,所含胶原蛋白和弹力蛋白约各占55% 及13%，并有丰富的黏多糖和糖蛋白等基质。瓣膜基质的完整性对瓣膜钙化和瓣叶各层间剪切应力损伤均有保护作用的环氧氯丙烷是本单位筛选的生物瓣膜防钙化剂，前期实验证明EC处理生物瓣膜的方法在体外钙沉积实验中同样具有防钙化效果。    　　MMPs是一组同源的以无活性酶原形式分泌的Zn2 +依赖性肽链内切酶。最早是由Gross和Lapiere在研究蝌蚪形态变化时发现的[8]。该酶在体内可广泛表达[9]，直接以酶原形式分泌到基质中，并在正常生理条件下发挥作用，由于均使酶活化，所以，MMPs激活具有瀑布放大效应。目前，已发现的MMPs有近30种，在人类至少23种已被识别和定性[10]。根据其底物敏感性不同分四类：间质胶原酶、明胶酶、间质溶解素和膜型金属蛋白酶。MMPs在体内几乎能降解胞外基质的所有成分。在正常稳定状态的组织中MMPs表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下和细胞转移化过程中其表达量上升，主要参与胞外基质的降解或重构、炎症反应、肿瘤的扩散转移、缺血缺氧损伤、动脉粥样硬化(AS)等各种生理及病理过程。MMP1[11]是MMPs家族重要的一员，又称成纤维细胞型胶原酶或间质胶原酶，是由成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞分泌的，主要降解间质胶原如：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、X型胶原和蛋白聚糖的核心蛋白。MMP3[12]属于间质溶解素，除了能降解胶原外，还能降解基底膜成份。MMP3通过对胶原的降解激活其他的MMPs。MMP3表达增加势必导致胞外基质降解增加，胶原纤维暴露增加，最终影响心脏瓣膜的机械强度和使用寿命。

由于MMPs是溶解细胞外基质的主要酶类，它们可以降解形成基质及基底膜的所有胶原、蛋白多糖及层黏连蛋白等成分，而瓣膜钙化的关键在于底层胶原纤维的暴露和基底膜的缺损。因而，MMPs被认为与瓣膜的钙化密切相关。本实验通过RTPCR法测定两组中MMP1和MMP3的mRNA表达情况，显示实验组的MMP1和MMP3表达降低，证实环氧氯丙烷可以抑制MMP1和MMP3的mRNA表达，从而减缓生物瓣组织中胶原纤维和基底膜的降解，有效的防止瓣膜钙化的形成。其机制可能是，环氧氯丙烷改变性质，封闭了胶原纤维的游离羧基，减轻了生物瓣的炎症反应，从而抑制了MMPs的活化。    　　本实验的RTPCR结果证实，经EC处理的生物瓣的MMP1和MMP3的mRNA的表达降低，可以防止瓣膜钙化的形成。但是，MMPs是一个庞大的家族，在此基础上，仍需要进一步的研究。

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