EGCG抑制肺癌细胞增殖及其机制的研究

作者:孙辑凯,黄立军,常东胜

作者单位：齐齐哈尔医学院药学系实验中心，黑龙江 齐齐哈尔 161042， 第四军医大学唐都医院胸外科，陕西 西安 710038    　　Effect of epigallocatechin3gallate (EGCG) on proliferation of human lung cancer cell and its mechanism

　　SUN JiKai, HUANG LiJun, CHANG DongSheng

　　Department of Pharmacology, Qiqihar Medical College, Qiqihar 161042,  China, Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China

　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of epigallocatechin3gallate ( EGCG) on the proliferation of lung cancer cells and its mechanism. METHODS: Human lung cancer cell line A549 was cultured with and without EGCG and its suppressed curve was drawn. Apoptosis of the cells was analyzed by Hoechst staining. The expressions of survivin mRNA and protein were investigated by RTPCR and Western Blot. RESULTS:  EGCG inhibited the proliferation of the lung cancer cell A549 and cell apoptotic rate was increased to 18% when A549 was cultured with 60 mg/L  EGCG (P<0.01). The expression of survivin was inhibited significantly in A549 cells treated with 60 mg/L EGCG.  CONCLUSION: EGCG can inhibit the growth of human lung cancer cells and induce cell apoptosis. Its mechanism may be associated with blocking survivin expression.

　　【Keywords】 epigallocatechin3gallate(EGCG); lung neoplasms; survivin; apoptosis

　　【摘要】 目的： 研究表没食子儿茶素3没食子酸酯(EGCG) 对人肺癌细胞增殖的影响及机制. 方法： 培养肺癌细胞A549，加入EGCG制作细胞抑制曲线； EGCG作用于人肺癌A549细胞株前后通过Hoechst染色检测细胞凋亡. RTPCR 及Western Blot印迹法研究survivin的mRNA 及蛋白表达的变化. 结果： EGCG可明显抑制A549细胞的增殖, 60 mg/L EGCG作用后,细胞出现明显的凋亡. 同时肺癌细胞中survivin mRNA 和蛋白表达减少. 结论： EGCG可抑制肺癌细胞的增殖,这可能与survivin表达降低有关.

　　【关键词】 表没食子儿茶素3没食子酸酯；肺肿瘤；survivin；细胞凋亡

　　0引言　　　　肿瘤的发生是多种因素综合作用的结果. 抗肿瘤机制主要有直接细胞毒作用、诱导癌细胞凋亡或分化、抗突变、抗肿瘤转移、抗肿瘤多药耐药等作用［1］. 表没食子儿茶素3没食子酸(EGCG)是茶多酚中最主要的成分［2］，其对于肺癌细胞的影响报道较少. 本研究发现表没食子儿茶素3没食子酸酯(epigallocatechin3 gallste, EGCG)对肺癌细胞有明显的诱导凋亡作用，而抑制凋亡抑制基因survivin的表达可能是其潜在机制之一.

　　1材料和方法

　　1.1材料表没食子儿茶素3没食子酸(EGCG) 购自Sigma 公司. 人肺癌细胞系A549为本室保存. 采用DMEM 培养基(含100 mL/L小牛血清, 10万U/L 青霉素, 10万U/L链霉素) ,在37℃  50 mL/L   CO2培养箱内进行培养. EGCG以无血清DMEM培养基稀释冻存于-20℃.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞毒试验(MTT法)将常规培养的A549细胞用胰蛋白酶消化后制成1×105/L的单细胞悬液，加入96孔细胞培养板中每孔0.2 mL，培养24 h后，换含不同浓度的EGCG培养液，每浓度设6复孔，培养48 h. 实验终止前4 h每孔加入MTT 液(5 g/L) 20 μL ，继续培养4  h . 小心吸去上清液后每孔加入DMSO 150 μL，在振荡器上轻轻振荡5 min 后，酶标仪测定各孔的吸光度值(A490 nm) ,按下式计算各用药组的生长抑制率IR(%):生长抑制率IR(%) = (1 -用药组平均A490 nm/对照组A490 nm)×100 %.

　　1.2.2Hoechst染色EGCG处理48 h后的肺癌细胞与对照组细胞制作细胞爬片，用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次. 吸弃PBS，加入0.5 mL Hoechst染色液，染色10 min, 染色时摇动数次. 之后吸弃染色液，加一滴抗淬灭液于载玻片上，细胞面朝下轻轻放在载玻片液滴上，荧光显微镜下观察凋亡.

　　1.2.3survivinRTPCR将EGCG处理48 h后的肺癌细胞与对照组细胞以TRIZOL Reagent提取总RNA，紫外分光光度计准确定量，相同条件下进行反转录survivin上游引物P1: 5′CGGAATTCATGGGTGCCCCGACGTTG 3′；下游引物 P2;5′C GGGATCCTCA ATCCATGGCAGC CAGC3′. 预计片段为420 bp同时以人βactin为内参照. βactin的引物序列为：P1： 5′TGGGCATGGGTCAGAAGG GATTC3′; P2: 5′ATGTCACGCACGCACGATTTCCCG3′， 预计片段为502 bp. PCR条件以94℃变性5 min后，按下述参数循环25次：94℃变性15 s，57℃退火 40 s，72℃延伸1 min.

　　1.2.4Western Blot检测survivin收集EGCG处理48 h后的肺癌细胞与对照组细胞PBS洗两遍后，离心. 加入RIPA细胞裂解液，收集上清. 按照BCA Protein Assay Kit说明书操作,酶标仪蛋白定量. 蛋白样品各取100 μg，150 g/L  SDSPAGE电泳后，转膜. TTBS洗膜. 将羊抗人survivin抗体用TTBS按1∶1000稀释，膜置于一抗中室温缓摇1 h. 37℃ TTBS洗膜. 将辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG用TTBS按1∶10 000稀释，室温1 h. 37℃洗膜按照Supersignal  West Pico Chemiluminescent Substrate说明书，配置发光工作液. 暗室操作曝光底片. 同时取各蛋白样品100 μg，同样方法进行βactin检测. (鼠抗人βactin 1∶2000稀释,辣根酶（HRP）标记兔抗鼠IgG 1∶10 000稀释).

　　2结果

　　2.1EGCG对A549细胞的抑制作用不同浓度EGCG作用于A549细胞48 h后,细胞生长有不同程度的抑制作用,且有明显的浓度依赖性. 当浓度大于60 mg/L以上时,对细胞生长均有显著的抑制作用 (图1).

　　2.2EGCG 对A549细胞的凋亡诱导作用Hoechst染色后，发现肺癌细胞经60 mg/L EGCG处理后部分染色质固缩，在荧光显微镜下，呈现出致密浓染或碎块状浓染，说明凋亡细胞大量增加. 随机计数10个高倍视野细胞核，计算凋亡率. 未加入EGCG的对照细胞凋亡率1.8%，治疗组11.2％（图2）.

　　2.3RTPCR检测survivin基因总RNA经反转录，相同条件下25个PCR反应循环后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，作为内参照的βactin（502 bp）， 两组PCR样品DNA量基本一致. 对照细胞有约420 bp特异的survivin DNA条带，EGCG 60 mg/L作用48 h后仅有非常微弱的条带（图3）.

　　图1EGCG对A549细胞的抑制作用（略） 　　A：对照组细胞；B：EGCG 60 mg/L作用48 h.

　　图2EGCG对A549细胞的凋亡诱导作用Hoechst ×400（略）

　　M： DNA marker；1：对照细胞组；2：EGCG 60 mg/L作用48 h.

　　图3EGCG 作用后A549细胞中survivin的 RTPCR检测（略）

　　2.4Western Blot检测survivin蛋白两组细胞βactin，均有显示，量基本相同. 对照组survivin蛋白条带明显存在，治疗组同样位置的条带则非常弱. 说明其survivin的蛋白表达受到明显抑制（图4）.

　　1：EGCG 60 mg/L作用48 h；2：对照组细胞.

　　图4EGCG作用后A549细胞中survivin蛋白Western Blot检测（略）

　　3讨论   　　茶多酚是从绿茶中提取出来的最主要的对人体最有益成分，是一类存在于茶树中的多羟基酚类化合物的混合物，俗名茶单宁、茶鞣质. 其主要组分为儿茶素类(黄烷醇类)、黄酮及黄酮醇类、花色素类和酚酸及缩酚酸类多化合物的复合体. 其中儿茶素类约占总量的80％，包括4种形式：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，没食子儿茶素(EGC)，儿茶素没食子酸酯(ECG)，儿茶素(EC). 其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 含量最高， 占儿茶素的50% 左右［3-4］. 　　　　研究表明茶多酚对肺癌细胞的生长具有明显的抑制作用. 其抑制肿瘤细胞生长的机制尚不十分清楚. 陈清勇等［5］应用MTT法体外观察不同浓度茶多酚(I)对人肺癌细胞株(PG)细胞的杀伤作用，结果显示I可明显抑制PG细胞表面CD44，CD54的表达. I对PG细胞和静息血管内皮细胞的黏附性也具有明显的抑制作用，并可抑制黏附分子C7344，CD54的表达，呈剂量依赖关系. I的抗黏附作用可能与其抗肿瘤转移有关. Banerjee 等［6］发现茶多酚可以通过抑制 Cox2，诱导caspase3表达抑制肺癌细胞的生长.

　　本研究通过细胞毒实验（MTT）发现EGCG很小浓度就能抑制A549细胞的生长，Hoechst染色后，发现肺癌细胞经60 mg/L EGCG处理后部分染色质固缩，在荧光显微镜下，呈现出致密浓染或碎块状浓染，说明凋亡细胞大量增加. 凋亡率明显高于对照组. survivin在许多肺癌组织中表达，是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子［7］. 本研究通过Western Blot法检测两组细胞survivin蛋白表达，结果发现治疗组其survivin的蛋白表达受到明显抑制，说明EGCG可能通过抑制Survivin蛋白表达途径促进肺癌细胞凋亡.

【参考文献】  　　［1］Yang CS, Lambert JD, Hou Z, et al. Molecular targets for the cancer preventive activity of tea polyphenols［J］. Mol Carcinog, 2006,45(6):431-435.

　　［2］Ahmad N, Gupta S, Mukhtar H. Green tea polyphenol epigallocatechin3gallate differentially modulates nuclear factor kappaB in cancer cells versus normal cells ［J］. Arch Biochem Biophys, 2000,376(2):338-346.

　　［3］盛丽，任爱梅．天然抗氧化剂茶多酚［J］．化学教育，2004,25(11)：8，29．

　　［4］汪新． 茶多酚的应用研究与皖南茶竹资源的开发［J］．中国资源综合利用，2004,9:26.

　　［5］陈清勇，王彦钊，周建英．茶多酚对肺癌PC细胞生长的调控研究［J］．中国现代应用药学，2002,19(6):440-442.

　　［6］Banerjee S, Manna S, Mukherjee S, et al. Black tea polyphenols restrict benzopyreneinduced mouse lung cancer progression through inhibition of Cox2 and induction of caspase3 expression［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2006,7(4):661-666.

　　［7］Singhal S, Vachani A, AntinOzerkis D, et al. Prognostic implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in nonsmall cell lung cancer: A review［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11(11):3974-3986.