食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

作者:杨章民,郭张燕,许丽艳

作者单位：汕头大学医学院：1生物化学与分子生物学教研室；2肿瘤病理研究室，广东 汕头 515041；3陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062；基金项目:国家自然科学基金面上项目（30170428，30370641，30570849）          【摘要】  　　目的：对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法：应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段，并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic（pGLB）中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRLTK共转染EC109细胞，48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度，并结合生物信息学分析，以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果：用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明，与对照组相比，上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现，在启动子区(-436～+1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论：在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.

【关键词】  fascin基因； 食管肿瘤； 启动子； 荧光素酶类； 报告基因

　　Cloning and identification of fascin gene promoter region in esophageal carcinoma cells

　　YANG ZhangMin, GUO ZhangYan,  XU LiYan, GAO ShuYing, XIE JianJun, LI EnMin

　　1Department of Biochemistry and Molecular Biology, 　　2Department of Oncologic Pathology, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

　　3College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xian 710062, China

　　【Abstract】 AIM: To clone and identify the promoter region of fascin gene in esophageal carcinoma cells. METHODS: Five different length fragments of 5′ flanking region of fascin gene were amplified from the genomic DNA of EC109 (an esophageal cancer cell line) by using PCR and cloned into luciferase reporter gene vector pGL3Basic （pGLB）, which aids in verification of functional promoter elements. Then the relative luciferase activities of the report genes in the EC109 cells transfected with these recombinant plasmids were analyzed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay System (DLR). Bioinformatic analysis was also performed to determine the position of fascin gene promoter. RESULTS: Five serial deletion recombinant luciferase report gene expression vectors pBF-2900- -436 were successfully constructed by using DNA recombination technique. 48 h after cotransfection of these recombinant plasmids with control pGLB, pRLTK vector into EC109 cells, the relative luciferase activities of the cells transfected with these recombinant plasmids were all higher, as compared with controls. Bioinformatic analysis unveiled a TATA box (-34- -29), which was the marked regulatory element, in this promoter region (-436- +1). CONCLUSION: The promoter region of fascin gene is likely located in the region of 436 bp upstream of the transcriptional initiation site in esophageal carcinoma cells.

　　【Keywords】 fascin; esophageal neoplasms; promoter; Luciferase; Reporter Gene Assay

　　0 引言

　　研究表明，癌细胞侵袭转移的恶性行为是由于肌动蛋白结合蛋白等因素引起的细胞骨架异常重组所致［1］. 成束蛋白（fascin）是肌动蛋白结合蛋白中与癌细胞运动时丝状伪足、微棘异常形成有关的主要分子，在食管癌及许多上皮来源的肿瘤细胞系中高表达，与癌侵袭转移密切相关，被认为是癌早期转移诊断的重要生物标志［2-3］. 但目前该基因在肿瘤细胞中上调表达的分子机制尚不清楚. 我们拟从fascin基因上游调控区入手，采用系列缺失结合双荧光素酶报告基因检测分析法，初步鉴定其启动子区的所在位置，为鉴定食管癌细胞中与其启动子结合的转录因子、阐明其表达调控机制奠定基础，也为以其转录因子为靶分子进行肿瘤生物治疗提供依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　E.coli JM109菌株，萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic（pGLB），内参照荧光素酶报告基因表达载体pRLTK，PCR mix，LigaFast Rapid DNA Ligation System, 双荧光素酶报告基因分析系统(DualLuciferase Reporter Assay System)及限制性内切酶（KpnI, Mlu I, Hind III）(美国Promega公司)；质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit（美国QIAGEN 公司）；转染试剂Fugene6（Roche公司）； pMD18T Vector及LA PCR kit（日本TaKaRa公司）；食管癌细胞系EC109 由中国医学科学院肿瘤研究所林晨研究员惠赠；萤光发光计TD20/20 luminometer（Turner Designs）.

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　将食管癌细胞系EC109培养于含100 mL/L小牛血清,1×105 U/L青霉素,100 mg/L链霉素的199培养基中，50 mL/L CO2，37℃. 用含2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA的消化液消化传代.

　　1.2.2 PCR引物设计与合成

　　根据GenBank中报道的fascin基因上游调控区序列（Accession No. AY044229），运用Primer Premier 5软件，设计5对针对其上游调控区的系列缺失引物，由上海基康公司合成. 其中，5对引物中的下游引物相同（FasnR），上游分别针对不同的缺失部位，各引物的序列及目的片段的大小见表1.表1从食管癌细胞系EC109扩增 fascin基因5′侧翼区的引物（略）

　　1.2.3 PCR扩增

　　以食管癌细胞EC109基因组DNA为模板，以F2900和FasnR为引物，应用PCR mix 扩增fascin基因5′侧翼区约3000 bp片段，产物命名为3022. PCR条件为：94℃, 5 min预变性； 然后按照98℃ 20 s，63℃ 5 min, 共30个循环； 最后72℃延伸10 min. 再以pTF2900为模板，分别以F1848，F1435，F825，F436和FasnR为上、下游引物，应用PCR mix及与上述相同的反应条件扩增系列相差约500 bp的片段，产物命名为1970，1547，947，558. 各PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相.

　1.2.4 PCR产物的克隆及重组

　　质粒pTF-2900～-436的构建以食管癌细胞EC109基因组DNA为模板扩增的PCR产物直接克隆到pMD18T或pGEMT easy vector载体中，按试剂盒操作说明书进行. 用与扩增片段时的引物及相同的反应条件进行PCR来鉴定重组子，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，最后测序确认，5个质粒分别命名为pTF2900, pTF1848, pTF1435, pTF825, pTF436.

　　1.2.5 系列缺失表达载体的构建与鉴定

　　以Kpn I/Hind III双酶切pGLB, pTF2900，以Mlu I/Hind III分别双酶切pGLB和pTF1848, pTF1435, pTF825, pTF436. 分别回收线性化的pGLB及不同大小的目的片段，用T4 DNA连接酶分别在4℃过夜连接，转化JM109感受态细胞，试剂盒提取质粒，Kpn I/Hind III或Mlu I/Hind III双酶切鉴定重组子，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. 各重组子分别命名为pBF2900, pBF1848, pBF1435, pBF825, pBF436.

　　1.2.6 转染和双荧光素酶活性检测

　　用QIAprep Spin Miniprep质粒提取试剂盒分别提取pBF2900, pBF1848, pBF1435, pBF825, pBF436, 空载体质粒pGLB以及内参照质粒pRLTK，紫外分光光度法分别测定质粒浓度. 用Buffer EB将上述各质粒稀释至100 mg/L，内参照质粒pRLTK稀释至20 mg/L.将各种质粒分别与pRLTK 质粒按10∶1（V/V）混合. 将处于对数生长期的EC109细胞在转染前24 h接种于24 孔培养板中，待细胞密度达到60%～80 %融合时进行转染［4］. 48 h后收获细胞，进行双荧光素酶活性检测. 每种质粒设3个平行孔，不同批次的质粒转染实验重复3次，并分别记录相应的荧光素酶活性.

　　1.2.7 生物信息学分析

　　应用转录因子数据库（www.generegulation.com）中的软件AliBaba 2.1分析预测fascin基因5′侧翼-436~+1区段潜在的转录因子结合位点. 相关参数分别为：Pairsim to known sites为64，Match width in bp设为10，Min num of sites为5，Min match conservation设为80％.

　　统计学处理: 根据TD20/20型照度计配置的软件包计算各组相对光强度x±s. 以SSPS 11.0 for Windows软件包对各组实验数据之间是否有显著性差别进行F检验.

　　2 结果

　　2.1 fascin基因5′侧翼区的克隆与pBF2900表达载体的构建

　　琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物3022，所扩增的片段大小与预期长度一致（图1A）.  将PCR产物克隆至中间载体pMD18T vector中，用PCR方法鉴定所构建重组子pTF2900，对pTF2900进行双向测序及BLAST分析，所扩增的约3000 bp DNA片段为人fascin基因5′侧翼区，与GenBank数据库中的fascin基因上游序列的一致性为99.9%. 双酶切法鉴定重组表达载体pBF2900，切出的目的片段大小与原PCR片段大小相同（图1B）.

　　2.2 fascin基因5′侧翼区的分段克隆及系列缺失表达

　　载体的构建PCR产物1970，1547，947，558的琼脂糖凝胶电泳结果见图2A. PCR产物克隆至中间载体pGEMTeasy vector中所构建的重组子pTF1848～pTF436用PCR方法鉴定后再分别进行测序确认. 双酶切方法鉴定所构建重组表达载体pBF1848，pBF1435，pBF825和pBF436，切出的目的片段大小与原PCR片段大小相同（图2B）.

　　2.3 细胞转染及相对荧光强度

　　将5个重组实验质粒分别与对照质粒pGLB、内参照质粒pRLTK共转染食管癌细胞EC109，利用双荧光素酶报告基因检测系统检测相对荧光强度（图3）.与pGLB空载体相比，从pBF2900到pBF436，各重组质粒的相对荧光强度均较高（P<0.01），表明fascin基因上游自转录起始位点起（此位点为＋1）， 从-2900缺失截短到-436时仍然具有启动报告基因转录的能力，其中pGLB436为最强. 在-2900到-1435缺失后，荧光素酶活性逐步上升增高，表明该区域可能存在一抑制子，因此推测fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.

　　2.4 生物信息学分析

　　在转录起始位点上游存在许多潜在的转录因子结合位点（图4），例如Sp1，C/EBPα，CREB等，在-34～-29位置也发现了启动子标志序列TATA盒(TATAAAA). 表明食管癌细胞中fascin基因的启动子位于其5′侧翼区-436区段.

　　3 讨论

　　Fascin又名成束蛋白［1］. 人类fascin基因是20世纪90年代从人类畸胎瘤中克隆，定位于染色体7p22［5］，编码的蛋白产物约55 ku. 正常情况下，fascin在脑、卵巢及睾丸中高表达，在T淋巴细胞和部分上皮细胞系中低表达或不表达，在神经细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、成熟树突状细胞中高表达. 近来研究发现，fascin在多种上皮来源的肿瘤细胞系中上调表达，例如在乳腺癌细胞系MDAMB435中, fascin表达增加（mRNA及蛋白水平）［6］，在非小细胞肺癌中表达上调，并与肿瘤分期及增殖分数相关［7］，在胃癌中，fascin基因在正常胃黏膜上皮中不表达，而在肿瘤中表达上调，且与肿瘤浸润程度呈正相关［8］. 我们在研究食管癌细胞中发现，fascin基因高表达不仅与肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为密切，还与肿瘤细胞的分裂增殖相关，通过RNAi技术抑制fascin基因表达后，食管癌细胞的侵袭转移行为明显减弱［9］.提示fascin的表达具有明显的细胞/组织和时空特异性.

　　有研究发现当神经元前体细胞NT2中的一种转录激活因子cAMP反应元件结合蛋白被用RNAi技术沉默后，fascin基因的表达明显下降［10］；最近在黑腹果蝇的γ神经元也确认CREB结合蛋白是调控fascin基因表达的关键因子，而且fascin基因表达直接影响神经元的分化［11］. Bros等［12］报道在树突状细胞（DC）成熟过程中，fascin基因的表达明显增强，并且发现位于TATA box附近的CREB/AP1混合元件区是调控fascin基因在DC中表达的关键元件. 在乳腺癌肿瘤细胞中，cerbB2的过表达会导致fascin基因表达的上调，但尚未鉴定出调控这一途径的转录因子［6］. 这些研究结果提示在上皮类细胞中fascin基因的表达调控机制可能与非上皮类细胞如神经细胞和DC细胞不同. 我们在以往工作的基础上，首先从EC109食管癌细胞基因组DNA中扩增出了fascin基因5′侧翼转录调控区不同长度DNA片段，并分别插入pGL3Basic载体中，成功构建了一系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pBF-2900～-436. 然后通过转染食管癌细胞后检测报告基因活性发现fascin基因5′侧翼转录调控区存在较强的启动子活性，初步鉴定出fascin基因启动子区应位于转录起始位点上游-436 bp内，但若进一步确定其核心启动子区及主要的转录调控元件，尚需嵌套缺失和定点突变等技术来实现. 我们的实验结果为深入研究fascin基因在上皮起源的肿瘤中过表达的分子机制奠定了基础.致谢感谢汕头大学医学院肿瘤病理学研究室蔡唯佳老师在细胞培养中给予的帮助和支持.

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