实时荧光定量 PCR检测野生型p53介导蛋白磷酸酶mRNA在非小细胞肺癌中的表达

　　作者：张伟,赵吉星,罗红鹤,鲁建军　　作者单位：中山大学附属第一医院胸外科， 广东 广州

　　【摘要】【目的】 荧光染料Ⅰ(SYBR GreenⅠ)是一种较为常用的非探针类定量PCR的方法，其结果具有一定特异性。本研究的目的是建立检测野生型p53介导蛋白磷酸酶(Wip1)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR的方法，了解肺癌组织及其远癌正常肺组织中Wip1的表达水平，研究肺癌组织中Wip1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系。 【方法】 利用相对定量的方法检测44例肺癌及相应远癌正常肺组织中Wip1 mRNA相对于β-actin mRNA的表达量，进行相对定量分析。 【结果】 44例非小细胞肺癌(NSCLC)及相应远癌正常肺组织均有Wip1 mRNA的表达，其中17例非小细胞肺癌中Wip1 mRNA高表达，占38.6%，两者表达差异有统计学意义 (Ratio = 2.1644 ± 1.394，P < 0.05);分化程度低的肺癌组织中Wip1 mRNA表达量显著高于分化程度高者(F = 5.08，P = 0.013)。 【结论】 SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法可以成功地检测Wip1基因的表达量。初步检测结果显示Wip1可能是一种肺癌发生发展过程中的致癌因素。

　　【关键词】 非小细胞肺癌; Wip1基因; 实时定量聚合酶链反应

　　Expression of Wip1 mRNA in Non-small Cell Lung Cancer by Real-time PCR

　　ZHANG Wei， ZHAO Ji-xing， LUO Hong-he， LU Jian-jun， MA Jun， GU Yong*

　　(Department of Thoracic Surgery， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】 The aim of this study was to establish a quantitative SYBR Green Ⅰ real-time PCR method for detection of wide-type p53-induced phosphatase 1 (Wip1 or PPM1D) gene expression level in non-small cell lung cancer (NSCLC)， and to investigate the relationship between Wip1 mRNA expression level and the clinicopathological characters. 【Method】 Real-time PCR was employed to determine the expression level of Wip1 mRNA in 44 specimens of NSCLC tissues and their adjacent normal tissues. 【Results】 In the 44 specimens， the expression of Wip1 mRNA in both cancer tissues and adjacent normal lung tissues were positive. Wip1 gene was overexpressed in 17 specimens among 44 NSCLC specimens. The rate was 38.6%. The relative level of Wip1 mRNA in NSCLC tissues was significantly higher than the adjacent normal lung tissues (Ratio = 2.1644 ± 1.394， P < 0.01). The expression of Wip1 mRNA was also correlated with pathological staging (F = 5.08， P = 0.013). 【Conclusion】 The established SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR method can successfully detect the expression level of Wip1 mRNA. The results suggested that Wip1 may be involved in the development of NSCLC.

　　Key words： non-small cell lung cancer; Wip1; real time fluoresene quantitative PCR

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(4)：463-467]

　　肺癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一。目前，有若干相关分子标志物运用于临床，用于指导肺癌的诊断、治疗与预后评价。但现有的证据还不足以解释肺癌的发病原因，因此，从分子水平深入研究其癌变机理，寻找新的标志基因具有重要意义。Wip1是蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族成员之一[1]，它被证实为一种新的原癌基因，其致癌机制是通过直接或者间接途径抑制p53基因功能而导致肿瘤的发生[2-3]。国外研究证实Wip1 基因在约11%乳腺癌组织中呈高表达[4]，另外在卵巢透明细胞癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胃癌、髓母细胞瘤中也呈高表达[5-9]，然而到目前为止尚无文献报道其在肺癌中表达水平状况。本研究采用SYBR GreenⅠ实时定量PCR技术，检测44例NSCLC患者肺癌和远癌正常肺组织中的Wip1 mRNA，为进一步研究Wip1基因在肺癌发生、发展中的作用奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织标本

　　选取2006年5月至2007年7月中山大学附属第一医院胸外科接受手术的肺癌患者共44例，收集肺癌和远癌正常肺组织标本，病例资料中男性34例，女性10例;年龄38 ～ 79岁，平均57.4岁;根据WHO标准分型：鳞癌14例，腺癌30例;低分化24例，中分化9例，高分化11例;淋巴结N0 27例，N1 10例，N2 7例;TNM分期(国际UICC1997年分期标准)：Ⅰ期 9例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期2例。标本离体30 min内取出肿瘤组织及远离肿瘤边缘大于5 cm组织作为正常对照于冻存管，立即投于液氮中，然后转移 -80 ℃冰箱保存，备RNA提取。

　　1.2 试 剂

　　总RNA提取试剂Trizol为invitrogen 公司，RT逆转录试剂盒为TOYOBO公司，SYBR GreenⅠ为Invitrogen 公司， dNTPs为Sigma公司， Taq酶为美国ABI公司。

　　1.3 仪 器

　　紫外分光光度仪为Beckman公司，凝胶成像及分析系统为Bio-Rad公司，ABI 3900高通量DNA合成仪为ABI 公司。

　　1.4 总RNA制备

　　收集新鲜的肺癌组织和远癌正常肺组织0.1 ～ 0.2 g，分别加入1 mL Trizol，按试剂说明书中操作步骤进行RNA提取。经凝胶电泳后，使用紫外分光光度仪检测提取总RNA的质量和浓度，要求A260/A280比值在1.8 ～ 2.0，并计算RNA含量。

　　1.5 cDNA的合成

　　反应体系20 μL。 总RNA 1 mg， Oligo(dT)15 primer 1 μL， 5 × RT buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，RNA inhabitor 1 μL，dNTPs 2 μL，加RNA free H2O至20 μL，离心混匀后42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min进行逆转录，合成的cDNA置于-80 ℃保存备用。

　　1.6 引 物

　　引物由广州达安基因公司合成。Wip1上游引物5′-AAGAAACTGGCGGAATGGC-3′，下游引物5′-CCAAGAACCACCCCTGAGTC-3′，扩增片段长度为131 bp。β-action基因上游引物5′-GCATG GGTCAGAAGGATTCCT-3′，下游引物5′-TCGTCCC AGTTGGTGACGAT-3′，扩增片段长度为106 bp。

　　1.7 标准曲线的制备及线性范围的确定

　　将任意肿瘤组织的cDNA作为标准品，将已制备的相对定量标准品(cDNA)按 1：10 倍比稀释得到不同浓度的标准模板，人为地将其起始拷贝数规定为104、105、106、107、108。同样将已制备的β-actin相对定量标准品(cDNA)也按 1：10 倍比稀释得到不同浓度的标准模板，人为地将其起始拷贝数规定为104、105、106、107、108、109。将标准品与样品一起进行Real-time PCR 反应，以起始拷贝数的自然对数为横坐标，以CT值为纵坐标，分别绘制Wip1 和β-actin基因Real-time PCR的标准曲线。

　　1.8 PCR反应

　　50 μL体系。反应条件：93 ℃ 3 min预变性， 93 ℃ 30 s， 55 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 40个循环。所有反应信息资料被 ABI 3900扩增仪收集并储存于其附件电脑含相应的分析软件中。

　　1.9 PCR产物的确定和溶解曲线分析

　　将所扩增的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析。溶解曲线分析模式定为：95 ℃5 min，55 ℃ 20 s，以0.1 ℃/s缓慢加热至94 ℃，最后设置为40 ℃ 20 s。

　　1.10 数据处理及结果分析

　　Real-time PCR原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。每个标本重复3次，取Ct值的平均值，每次试验设阴性对照，以H2O代替cDNA。Pfaffl法是用公式计算基因的相对表达量，参照体系就是预先假定目的基因在其表达量为1 × 的体系。那么目的基因在其他体系的表达量为相对于参照体系该基因的N倍，本试验以癌旁正常组作为参照体系。Wip1基因在肺癌组与癌旁正常组表达差异倍数的计算公式如下：Ratio = Etarge△Cptarge(control-sample)/ E ref△Cpref(control-sample)。

　　1.11 统计方法

　　采用REST-XL?鬁软件作基因表达的相对定量统计学分析。应用SPSS13.0统计软件对各组间差异分析采用检验法t检验、单因素方差分析、q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 标准曲线和相关系数

　　Wip1和β-actin标准曲线(图1、2)，斜率分别为 -3.295和 -3.632，相关系数分别为0.9995和0.9949。

　　2.2 PCR产物的确定分析

　　琼脂糖凝胶电泳显示所得的产物为目的条带(图3);溶解曲线分析显示Wip1基因PCR产物的溶解曲线峰值在85.0 ℃，溶解温度均一，峰的形状较为锐利，β-actin基因PCR产物的溶解曲线的峰值在87.0 ℃，峰形锐利 (图1、2)。

　　2.3 NSCLC及远癌正常肺组织中Wip1 mRNA 的表达

　　经检测Wip1 mRNA 在NSCLC及相应远癌正常肺组织均有表达。采用Pfaffl法计算Wip1 mRNA的表达水平，Wip1 mRNA在 NSCLC 中表达水平明显升高，其相对表达量Ratio为2.1644 ± 1.394， 44 例肿瘤样本中有17例 Wip1 mRNA的表达水平是相应癌旁正常肺组织2倍以上，占38.6%。REST-XL?鬁 统计软件分析，在NSCLC及远癌正常肺组织Wip1 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P﹤0.01)。

　　2.4 NSCLC中Wip1 mRNA的表达与临床病理特征的关系

　　非小细胞肺癌组织中，鳞癌与腺癌组织中Wip1 mRNA的表达量无明显差别(t = 0.687，P = 0.503);Wip1 mRNA的表达量在不同临床分期之间(F = 0.349，P = 0.79)、淋巴结转移之间(F = 0.361， P = 0.70)均无差异性(表1)。Wip1 mRNA的表达量在不同肿瘤分级之间(F = 5.08， P = 0.013)差异有统计学意义。肺癌组织分化程度越低，Wip1 mRNA表达越高;肺癌组织分化程度越高，Wip1 mRNA表达越低。

　　3 讨 论

　　本研究应用SYBR GREEN I荧光定量 PCR技术，它是一种用于定量检测起始模板的新技术[10]。与传统的定量分析方法相比，定量更准确。Real-time PCR 技术实现了每一轮循环均检测一次荧光信号，并记录在电脑软件中，计算每个样品的Ct值，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量。PCR循环在到达Ct值所在循环数时，刚刚进入指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此有很好的重现性。但是， SYBR Green Ⅰ荧光染料是一种能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的染料，它与PCR合成的双链DNA结合后产生荧光。如果反应过程中出现非特异性双链产物(如引物二聚体等)，就会造成定量不准确的后果，特异性降低。我们采用溶解曲线来分析每次PCR反应的特异性。理想的溶解曲线只有单一峰型的曲线，如出现两个以上峰型，说明有引物二聚体或者非特异性扩增的产生。

　　Real-time PCR定量方法主要分为相对定量和绝对定量。绝对定量是对未知样品绝对量(拷贝数)进行测定的方法，是比较准确可靠的基因表达定量方法，但这种方法需要克隆目的基因和参照基因的扩增片段，构建体外转录系统，通过体外转录获得已知拷贝数的标准品，用于构建标准曲线，这些过程增加了实验的难度和复杂性。传统相对定量法是用2-△△Ct计算实验组相对于对照组目的基因表达的变化倍数，这种方法将PCR的扩增效率设定为1。在实际的PCR扩增中，随着循环数的增加，PCR产物增加， 引物和底物的浓度降低，扩增效率会下降。另外，随着热变性次数的增加，DNA聚合酶的活性降低，也会导致扩增效率的下降，这些因素决定了实际的PCR扩增效率不可能达到1。因此，这种方法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高，误差较大。另一方面，在相对定量时，目的基因和参照基因的扩增效率不可能完全相同，也会对结果造成影响。传统2-△△Ct是一种不准确的相对定量方法。为了避免2-△△Ct和绝对定量方法的不足，在本实验采用了一种新的简便的相对定量方法，即Pfaffl法，该方法以待测样本任何一个cDNA作为相对标准品，在进行系列倍比稀释后用于构建标准曲线，获得目的基因和内参基因的斜率并计算出其扩增效率。利用Pfaffl法公式计算基因相对的表达量。该方法不仅避免了2-△△Ct法的不准确性，又大大简化了绝对定量的过程，能够获得跟绝对定量方法一致的结果[11]。

　　实验结果显示，Wip1 mRNA 在NSCLC组织中的表达水平明显升高，其相对表达量Ratio为2.1644 ± 1.394， 44例NSCLC有17例 Wip1 mRNA的表达水平高于远癌正常肺组织2倍以上，占38.6%。Wip1 mRNA在NSCLC及远癌正常肺组织表达水平差异有统计学意义(P < 0.01)。Wip1基因在肺癌组织中高表达，提示其可能与NSCLC的发生有关，也进一步支持Wip1是一种原癌基因的观点。

　　临床病理因素分析表明，Wip1 mRNA 的相对表达水平在有无淋巴结转移、TNM分期、病理组织类型组中无统计学差异(P > 0.05)，提示 Wip1基因的表达与 NSCLC组织类型、TNM分期和肿瘤淋巴转移无关。Wip1 mRNA表达在不同肺癌细胞分化程度组中的表达差异有统计学意义(P < 0.05;表1)。Wip1 mRNA在组织细胞低分化组表达水平高于高分化组表达水平。这些数据提示Wip1可能作为 NSCLC细胞分化以及肿瘤恶性程度的辅助指标之一。

　　【参考文献】

　　1 Fiscella M， Zhang H， Fan S， et al. Wip1，a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53-dependent manner[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1997，94(12)： 6048-6053.

　　2 Bulavin DV， Demidov ON， Saito S， et al. Amplification of PPM1D in human tumors abrogates p53 tumor-suppressor activity [J]. Nat Genet， 2002，31(2)：210-215.

　　3 Li J， Yang Y， Peng Y， et al. Oncogenic properties of PPM1D located within a breast cancer amplification epicenter at 17q23 [J]. Nat Genet， 2002，31(2)：133-134.

　　4 Yu E， Ahn YS， Jang SJ， et al. Overexpression of the wip1 gene abrogates the p38 MAPK/p53/Wip1 pathway and silences p16 expression in human breast cancers [J]. Breast Cancer Res Treat， 2007，101(3)：269-278.

　　5 Hirasawa A， Saito OF， Inoue J， et al. Association of 17q21-q24 gain in ovarian clear cell adenocarcinomase with poor prognosis and identification of PPM1D and APPBP2 as likely amplification targets [J]. Clin Cancer Res， 2003，9(6)：1995-2004.

　　6 Sain OF， Imoto I， Inoue J， et al. PPM1D is a protential target for 17q gain in neuroblastoma[J].Cancer Res， 2003，63(8)：1876-1883.

　　7 Loukopoulos P， Shibate T， Katoh H， et al. Genome-wide array-based comparative genomic hybridization analysis of pancreatic adenocarcinoma： Identification of genetic indication that predict patien outcome [J].Cancer Sci， 2007，98(3)：392-400.

　　8 Fuku T， Semba S， Yutori H， et al. Increased wide-type p53-induced phosphatase 1 (Wip1 or PPM1D) expression correlated with downregulation of checkpoint kinase 2 in human gastric carcinoma[J]. Pathol Int， 2007，57(9)：566-571.

　　9 Mendrzyk F， Radlwimmer B， Joos S， et al. Genomic and protein expression profiling identifies CDK6 as novel indepent prognostic marker in medulloblastoma[J]. J Clin Oncol， 2005，23(34)：8853-8862.

　　10 Heid CA， Stevens J， Livak KJ， et al. Real time quantitative PCR [J]. Genome Res， 1996，6(10)：986-994.

　　11 Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in rea1-time RT-PCR [J]. Nucleic Acid Res， 2001，29(9)：e45.